AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE
UNA MIOTOXINA DEL VENENO DE LA SERPIENTE Bothrops brazili HOGE, 1953 (OPHIDIA: VIPERIDAE)
INTRODUCCIÓN La mayoría de serpientes venenosas del Perú pertenecen al género Bothrops (Familia Viperidae), y ellas son responsables de la mayoría de accidentes ofídicos en nuestro país. Sus venenos se caracterizan por producir severo daño local incluyendo hemorragia y necrosis, y pueden ocasionar la muerte de la persona afectada, si ésta no es tratada adecuadamente. Los venenos de estas serpientes contienen, principalmente, una gran variedad de proteínas con actividad enzimática entre las que destacan una diversidad de enzimas proteolíticas, capaces de alterar la coagulación sanguínea y producir hemorragia. Igualmente las fosfolipasas son enzimas ampliamente distribuidas en estos venenos y ellas son responsables de la hidrólisis de fosfolípidos y de varios efectos biológicos como hemólisis, cardiotoxicidad, inhibición de la agregación de plaquetas, edema, etc. (Kini y Iwanaga, 1986a y 1986b). En particular, la necrosis del tejido muscular (mionecrosis) es un efecto característico del envenenamiento botrópico, que puede conducir a la disfunción o amputación de la zona afectada. En este proceso participan proteínas básicas denominadas miotoxinas, las cuales constituyen una familia de proteínas, estructural y antigénicamente relacionadas a las fosfolipasas. En este sentido, las miotoxinas botrópicas pueden ser de dos tipos: unas con actividad de fosfolipasa y otras sin actividad enzimática (Gutiérrez y Lomonte, 1997). La serpiente Bothrops brazili “jergón shushupe” (Familia Viperidae, Subfamilia Crotalinae) es una especie cuya distribución geográfica abarca los departamentos de Amazonas, Loreto, Madre de Dios y Ucayali (Carrillo e Icochea, 1995). Su longitud aproximada es de 1,8 metros y presenta un color pardo con dibujos triangulares más oscuros sobre el dorso. Su alimento principal son pequeños roedores y lagartijas (Carrillo, 1983). Cabe mencionar que las proteínas estudiadas de venenos de serpientes del Perú se han tratado exclusivamente de proteínas con actividad enzimática (Yarlequé et al., 1989; Pantigoso et al., 1996). En particular algunas de las proteínas que se han aislado y caracterizado en el veneno de B. brazili, son las enzimas similar a trombina (Limán, 1996), fosfolipasa (Zeballos et al., 1999) y proteolítica (Azañero et al., 2000). En este trabajo se describe el aislamiento y caracterización de una proteína no enzimática con actividad miotóxica, lo que constituye el primer reporte de este tipo en nuestro medio. MATERIAL Y MÉTODOS 1 Veneno. Se utilizó veneno de Bothrops brazili, de especímenes procedentes de la región del Alto Marañón, mantenidos en cautiverio en el Serpentario “Oswaldo Meneses” del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. El veneno extraído por presión manual de las glándulas venenosas fue liofilizado y conservado a – 8 °C. 2 Purificación de la miotoxina. 100 mg de veneno liofilizado de B. brazili fueron disueltos en 2 ml de buffer acetato de amonio 0,05 M, pH 7,0 y los restos insolubles se eliminaron por centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos. Se tomó 1,95 ml del sobrenadante y se aplicó a una columna de intercambio catiónico de CM-Sephadex C-50 (17 X 1,1 cm), utilizando como buffer de elución acetato de amonio 0,05 M pH 7,0. Las proteínas retenidas en la columna fueron eluidas agregando al buffer de corrida NaCl 0,3 M y 0,6 M. La corrida se realizó a temperatura ambiente, a un flujo de 8 ml/h y la proteína fue estimada por absorción de luz ultravioleta a 280 nm. El pico obtenido con NaCl 0,6M fue desalado por cromatografía de filtración empleando una columna de Sephadex G-25 (22 X 2,5 cm), luego de lo cual se evaluó la actividad miotóxica. 3 Cuantificación de proteína. El contenido proteico del veneno crudo y de la proteína purificada se determinó por el método de Lowry (1951). Para ello, 20 ml de la muestra se completaron con agua destilada hasta 0,5 ml y luego se agregó 2 ml de solución alcalina (carbonato de sodio al 4%, sulfato de cobre al 2% y tartrato de sodio y potasio al 4% 100:1:1), y se incubó a 37 °C durante 15 minutos. Después de este tiempo se agregó 0,5 ml de RFC 1:6 y luego de 30 minutos de reposo a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 660 nm. Como proteína estándar se utilizó albúmina bovina 0,1 mg/ml. Solamente durante el proceso de purificación de la miotoxina, el contenido proteico fue estimado midiendo la absorbancia de luz ultravioleta a 280 nm (Warburg y Christian, 1941). 4 Evaluación de la pureza. La pureza de la miotoxina fue determinada por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en condiciones nativas a pH 7,5 y también en condiciones denaturantes con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS), (Laemmli, 1970). Adicional-mente, la pureza fue evaluada por inmunodi fusión e inmunoelectroforesis en geles de agarosa al 1%. En la prueba de inmuno-electroforesis se utilizó suero antibotrópico polivalente del Instituto Nacional de Salud de Lima (Ouchterlony and Nilsson, 1978). En todos los casos las proteínas fueron teñidas con azul de coomassie. 5 Determinación del peso molecular. Se determinó por PAGE-SDS (Laemmli, 1970), empleando como proteínas estándares albúmina bovina (66 KDa), ovoalbúmina (45 KDa) y lisozima (14,3 KDa); cada proteína a una concentración de 2 mg/ml. El peso molecular también fue determinado por cromatografía de filtración en gel en una columna de Sephadex G-100 (18,9 x 2 cm), equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 7,0, y utilizando como proteínas estándares albúmina bovina 2 mg/ml (66 KDa), anhidrasa carbónica 2 mg/ml (29 KDa) y citocromo c 1 mg/ml (12,4 KDa) (Andrews, 1964). 6 Composición de aminoácidos. Para determinar la composición de aminoácidos de la miotoxina, 3 mg de proteína se hidrolizaron al vacío a 150 °C durante 24 h, con 400 ml de HCl 6N conteniendo fenol 1% y sulfito de sodio 0,1%. Luego, la muestra se dejó enfriar y secar al vacío durante 1,5 h y se resuspendió con 50 ml de EDTA 250 partes por millón. A continuación se volvió a secar al vacío y se resuspendió en 100 ml de buffer de acoplamiento (acetonitrilo: piridina: trietilamina: agua, 10:5:2:3). Luego de secar al vacío, una vez mas, se agregó 100 ml de buffer de acoplamiento y 5 ml de fenilisotiocianato (PITC), y se dejó a temperatura ambiente durante 5 min. Finalmente, luego de un último secado al vacío, se resuspendió en 100 ml de buffer acetato de amonio 0,05 M pH 6 (solvente A). 10 ml de esta muestra fueron utilizados para el análisis de aminoácidos por HPLC, empleando una columna de fase reversa octadecilo (C18) de 25 cm de largo por 4 mm de diámetro interno. La separación se realizó a 52 °C, empleando inicialmente el solvente A, y luego acetato de amonio 0,1M pH 6 en acetonitrilo, metanol y agua (44:10:46) (solvente B), de acuerdo al siguiente protocolo de elución: 15 minutos con 100% de solvente A, 15 minutos con 85% de solvente A y 15% de solvente B, 4 minutos con 50% de solvente A y 50% de solvente B, 6 minutos con 100% de solvente B y finalmente 10 minutos con 100% de solvente A. El resultado fue comparado con el perfil obtenido con 10 ml de una muestra estándar de 16 aminoácidos (25 mmol de cada aminoácido), tratados de manera similar (Heinrikson y Meredith, 1984). 7 Determinación de carbohidratos 7.1 DETERMINACIÓN DE HEXOSAS. En el veneno crudo y la miotoxina aislada, se determinó el contenido de hexosas de acuerdo al método de Winzler (1955). La mezcla de reacción contenía 0,3 ml de agua destilada, 0,2 ml de la muestra alcalinizada (veneno crudo 5 mg/ml o miotoxina 1 mg/ml, en NaOH 0,1N) y 2 ml del reactivo Orcinol 0,18% y ácido sulfúrico 19N. Esta mezcla fue incubada a 80 °C durante 15 minutos y después de enfriarla se midió la absorbancia a 540 nm. Los valores obtenidos fueron convertidos a mg de hexosa por comparación a un estándar que contiene una mezcla de manosa y galactosa 0,2 mg/ml, y finalmente se expresaron como porcentaje de hexosa respecto de la cantidad de proteína.
7.2 DETERMINACIÓN DE HEXOSAMINAS. La
determinación de hexosamina en el veneno crudo y la miotoxina aislada, se realizó por el
método de Winzler (1955). Inicialmente las muestras fueron sometidas a una hidrólisis
ácida a 100 °C durante 4 horas (0,2 ml del veneno crudo 10 mg/ml o MTX 2 mg/ml, con 1,8
ml de HCL 3N), y luego se agregaron 2 ml de NaOH 3N. De esta mezcla, se tomaron 0,3 ml que
se incubaron con 0,2 ml de agua y 0,5 ml de acetil acetona a 100 °C por 15 minutos.
Luego, se agregó 2 ml de etanol 95% y 0,5 ml del reactivo de Erlich (0,4 g de
p-dimetilaminobenzaldehído, 15 ml de metanol y 15 ml de H2SO4). Finalmente, después de
30 minutos de reposo a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 530 nm y los
valores obtenidos fueron convertidos a mg de hexosamina por comparación con un estándar
de glucosamina 0,5 mg/ml. Los valores se expresaron como porcentaje de hexosamina respecto
de la cantidad de proteína usada.
8 Actividad miotóxica. Cuatro
ratones albinos de 20 g de peso fueron inoculados vía i. m. con 0,1 ml de miotoxina (60
mg) en el músculo gastrocnemius. Luego de 24 horas, los animales se sacrificaron por
dislocación cervical, y una porción del músculo fue fijado en glutaraldehído al 3%
durante 2 horas y luego tratado con buffer fosfato 0,1 M pH 7 durante 3 horas.
Posteriormente, el tejido fue tratado con concentraciones crecientes de alcohol etílico
al 30, 50, 70, 80, 90, 96 y 100%, y finalmente embebido en una resina Spurr para cortar
secciones de 1 mm de espesor, que fueron teñidas con azul de toluidina al 0,5%. Los
daños morfológicos fueron observados y fotografiados a través de un microscopio de luz.
11 Actividad anticoagulante. Plasma humano citratado fue centrifugado a 4000 x g durante 20 minutos, a fin de obtener plasma pobre en plaquetas. Se incubó 200 ml de este plasma a 37 °C durante 10 minutos, con 0,1 ml de miotoxina (que contenía desde 2 hasta 30 mg de proteína). Enseguida se agregó 0,1 ml de CaCl2 25 mM, y se midió inmediatamente el tiempo de coagulación. La actividad anticoagulante fue determinada midiendo el retardo en el tiempo de coagulación del plasma, con respecto a un control sin miotoxina. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1 Purificación de la miotoxina. Al pasar el veneno crudo de B. brazili por la columna de CM-Sephadex C-50, se obtuvieron tres picos de proteína que eluyeron directamente con el buffer de corrida. Posteriormente, al incorporar NaCl 0,3 M en el buffer de elución, se obtuvieron tres picos más y finalmente empleando NaCl 0,6 M se obtuvo un sétimo pico, el cual mostró tener actividad miotóxica (Fig. 1); es decir, en este sistema la miotoxina interactuó fuertemente con el gel y sólo fue posible separarla con 0,6 M de NaCl, siendo la última proteína del veneno en ser eluida. Esto nos indica que la miotoxina a pH 7,0 adquiere una fuerte carga positiva, la cual le permite interactuar con los grupos carboximetil del gel cargados negativamente. Este hecho implica que el pI de la miotoxina es mayor que 7,0 y por lo tanto se trata de una proteína básica.
La naturaleza básica de esta proteína es una característica común a todas las miotoxinas aisladas de venenos de serpientes del género Bothrops, lo cual es aprovechado para separar esta clase de proteínas mediante cromatografía de intercambio catiónico a pH 7,0. Así, por ejemplo, podemos mencionar las miotoxinas aisladas de los venenos de B. asper y B. nummifer (Gutiérrez et al., 1984; Gutiérrez et al., 1986; Lomonte et al., 1990). Asimismo, Soares et al. (1998) emplean un solo paso cromatográfico para purificar la miotoxina de B. moojeni, y Toyama et al. (1995) hacen lo mismo con la miotoxina de B. pirajai, pero mediante HPLC. Por el método de Lowry et al. (1951) se determinó que la miotoxina aislada representa el 25% de la proteína total del veneno, lo cual denota la importancia que debe tener como componente del veneno, durante el proceso de envenenamiento y en la digestión de la presa. En el caso de las miotoxinas I y II del veneno de B. moojeni, ellas constituyen el 12% de la proteína total del veneno (Soares et al., 1998), mientras que la bothropstoxina de B. jararacussu representa el 15% (Homsi-Brandeburgo et al., 1988). 2 Evaluación de la pureza y peso molecular. La miotoxina aislada mostró tanto por PAGE en condiciones nativas, PAGE-SDS, inmunodifusión e inmunoelectroforesis, una sola banda de proteína, todo lo cual confirmó la idoneidad del método de purificación. Particularmente la electroforesis en condiciones nativas a pH 7,5 mostró la migración catódica de la miotoxina, debido a su naturaleza básica. Asimismo, la PAGE-SDS demostró que la proteína aislada corresponde a una única banda homogénea pero con diferentes movilidades electroforéticas, según las condiciones sean reductoras o no reductoras. El peso molecular estimado en condiciones reductoras fue de 15 Kda, mientras que en condiciones no reductoras, el peso fue de 30 KDa (Fig. 2); adicionalmente, la banda obtenida en condiciones no reductoras fue algo difusa. Estos resultados permiten deducir que la miotoxina aislada es una proteína constituida por dos cadenas polipeptídicas de 15 KDa cada una, y el hecho de que en condiciones no reductoras la banda proteica sea difusa indicaría que las cadenas polipeptídicas contienen varios enlaces disulfuro intracadena, lo que dificulta que las cadenas se desplieguen totalmente y queden homogéneamente cubiertas con SDS. Por otro lado, al calcular el peso molecular en condiciones nativas por cromatografía de filtración, se obtuvo un valor de 29 KDa (Fig. 3), lo cual guarda correlación con el valor calculado por PAGE-SDS en condiciones no reductoras, confirmándose que la proteína tiene 2 cadenas polipeptídicas.
4 Determinación del contenido de carbohidratos. Los análisis de hexosas y de hexosaminas de acuerdo al método de Winzler (1955) dieron resultados negativos con la miotoxina. Sin embargo, en el veneno crudo se halló 0,65% de hexosa y 1,33% de hexosamina. Esto demuestra que la miotoxina aislada no es una glicoproteína, lo que es coincidente con lo descrito en una amplia variedad de miotoxinas botrópicas. No obstante, los valores de 0,65% de hexosa y 1,33% de hexosamina, encontrados en el veneno crudo, serían producto de azúcares ligados a otras proteínas del veneno y azúcares libres. 5 Actividad miotóxica. El análisis histológico del músculo gastrocnemius de ratón tratado con miotoxina evidenció una severa necrosis del tejido, observándose no sólo una desorganización de las fibras musculares, sino además una gran infiltración de glóbulos blancos en el tejido (Fig. 5). Considerando que esta proteína carece de actividad de fosfolipasa, nuestros resultados corroboran lo señalado por algunos autores en el sentido de que la acción miotóxica no depende de la hidrólisis de fosfolípidos (Gutiérrez, 1984; Homsi-Brandeburgo et al., 1988; Gutiérrez et al., 1989). Asimismo se trataría de una miotoxina del grupo de las fosfolipasas K-49. Sin embargo, un aspecto particularmente importante y que está en pleno estudio, es la manera como esta proteína ejercería su acción destructiva sobre el tejido muscular, toda vez que es una proteína sin actividad enzimática. 6 Actividad edemática. La miotoxina de B. brazili fue capaz de inducir edema en la almohadilla plantar de ratones albinos. Los incrementos en peso obtenidos con 15, 30 y 45 mg, fueron de 15,1, 24,8 y 42,6% respectivamente, determinándose una DEM de 32,6 mg de proteína (Fig. 6). La actividad formadora de edema se define como el incremento en la permeabilidad microvascular que conduce a una extravasación de fluido y su acumulación en los espacios intersticiales de los tejidos. Sin embargo, muy pocos estudios se han realizado para determinar la naturaleza exacta del mecanismo del edema causado por miotoxinas, aunque en algunos casos se ha determinado la DEM. Así, por ejemplo, Lomonte y Gutiérrez (1989) han reportado que la miotoxina II de B. asper, tiene una DEM de 38 mg, la cual es similar a la encontrada en este trabajo para la miotoxina de B. brazili (32,6 mg). Un aspecto reconocido en la inflamación es la participación de fosfolipasas A2, las cuales incluso han sido aisladas de fluidos inflamatorios. Esta acción edemática de las fosfolipasas fue correlacionada con su capacidad para hidrolizar fosfolípidos (Lloret and Moreno, 1993). Sin embargo, la miotoxina de B. brazili, al igual que otras miotoxinas botrópicas, no tiene actividad enzimática, lo cual sugiere que su efecto edemático tampoco depende de la hidrólisis directa de fosfolípidos y que algún mecanismo alternativo estaría involucrado, por ejemplo, la acción directa de la miotoxina sobre células endoteliales. 7 Actividad hemolítica y anticoagulante. La miotoxina aislada no mostró tener actividad hemolítica directa sobre glóbulos rojos humanos, ni fue capaz de retardar el tiempo de coagulación del plasma humano recalcificado, lo cual guarda relación y es coherente con el hecho de que esta miotoxina carece de actividad de fosfolipasa. En particular, todas las miotoxinas que ejercen un retardo en la coagulación del plasma citratado y recalcificado muestran tener actividad de fosfolipasa, y se supone que es la capacidad de hidrolizar ciertos fosfolípidos, que participan en el proceso de coagulación sanguínea, lo que les confiere un efecto anticoagulante; tal es el caso de las miotoxinas aisladas de B. atrox y de B. asper (MTX I y III), todas las cuales tienen actividad de fosfolipasa y son a la vez anticoagulantes. En cambio la miotoxina estudiada en este trabajo es similar a las miotoxinas de B. nummifer, B. asper (MTX II) y B. moojeni (MTX II), en el sentido de que todas carecen de actividad de fosfolipasa y también de actividad anticoagulante (Prado-Franceschi et al., 1998). AGRADECIMIENTOS Esta investigación contó con el apoyo económico del CSI (Proyecto 001001141). Los autores agradecen de manera especial a los Biólogos Elizabeth Neyra y Miguel Neira por su valioso apoyo en el procesamiento histológico y determinación del contenido de aminoácidos, respectivamente.
_________________________________ 1 Lab. de Biología
Molecular. Facultad de Ciencias Biológicas. UNMSM. |
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