| Rev. peru. biol.
Vol. 8 • Nº 1 • 2001
© Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM |
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ESTUDIO FENOTÍPICO COMPARATIVO DE
CONSORCIOS MICROBIANOS
CON ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA DE SEDIMENTOS
MARINOS Y RIZÓSFERA
Débora Alvarado, Lidia Flores, Ana María
Guerrero, Zuleyka Vicente y Ruth García*
Resumen.-
Se colectaron 4 muestras de sedimentos tanto del fondo como de la orilla de la playa
«Marbella», Callao y 4 muestras de tierra agrícola a nivel de rizósfera obtenidas de
un viñedo de la localidad de «Grocio Prado» en la Provincia de Chincha, Ica. Se
determinó la densidad poblacional de microorganismos heterotróficos con actividad
quitinolítica presentes en estos ambientes, y se describió sus principales
características fenotípicas. Para la cuantificación de las poblaciones se empleó el
método del Número Más Probable (NMP). Los tubos con crecimiento positivo fueron
sembrados en placas con Agar Quitina Granulada y Agar Quitina Coloidal que fueron
incubadas a temperatura ambiental hasta por dos semanas. Con las colonias desarrolladas se
realizaron las pruebas de Oxidación/Fermentación de Glucosa, Oxidasa, Catalasa,
motilidad, presencia de flagelo, capacidad tintoreal al GRAM, producción de esporas y
actividad quitinolítica semicuantitativa. Se elaboraron fenogramas con el programa NTSYS
v.1,7. La mayor densidad de bacterias quitinolíticas fue encontrada en la rizósfera
alcanzando niveles ³1,6 x 105 en tanto que en sedimentos marinos la densidad osciló entre
2,2 x 102 a 1,6 x 104 NMP/g. Luego del análisis de agrupamiento de
los fenotipos mostrados por los consorcios estudiados, se encontró que presentaban
características distintivas, exhibiendo ambas una gran diversidad fenotípica.
Palabras clave: consorcios quitinolíticos, sedimento marino, rizósfera,
microorganismos heterotróficos, fenograma.
Abstract.-
Four samples of silts were collected from the bottom and the bank of the beach
“Marbella” in Callao and four samples of cultivated land were taken at level of
rhizosphere obtained from a vineyard of “Grocio Prado” Grassland’s town in
the Country of Chincha. The microbial heterotrophics populations with chitinolytic
activity present in these environments was determined quantitatively, being described its
main phenotypic characteristics. For the quantification of the populations the method of
the Most Probable Number (NMP) was used. The tubes with positive growth were sowed in
tubes with Granulated Chitin Agar and Colloidal Chitin Agar that were incubated at
environmental temperature for two weeks. With the developed colonies the following tests
were carried out: Oxidation/Fermentation of Glucose, Oxidase, Catalase, motility, presence
of flagellum, tintoreal capacity, production of spores and semiquantitative chitinolytic
activity. The phenograms were elaborated with the NTSYS v.1,7 program. The biggest density
of chitinolytic bacteria was found in rhizosphere reaching levels of ³1,6 x 105, as
long as in marine silts the density oscillated among 2,2 x 102 to 1,6 x 104
NMP/g. After the analysis of clustering of the phenotypes shown by the studied consortia
it was found that they presented distinctive characteristic, exhibiting both of them a
great phenotypic diversity.
Key words: chitinolytic consortia, marine silt, rhizosphere, heterotrophic
microorganisms, phenogram.
|
Introducción.-
La quitina es uno de los biopolímeros más abundantes en la naturaleza, encontrándose
principalmente en el ambiente marino donde forma parte del exoesqueleto de crustáceos y
otros invertebrados (Gooday, 1998). Así mismo, en ambientes terrestres, se la encuentra
conformando el tegumento de insectos y como constituyente primordial de la pared celular
fúngica.
La molécula de quitina consiste en residuos de N-acetil glucosamina unidos mediante
enlaces b-1,4. Estos residuos están dispuestos en sentido antiparalelo (a), paralelo (b)
o en ambos sentidos (g), de las que la configuración a es la más abundante. La gran
variedad de formas de quitina presentes en la naturaleza requiere de bacterias que tengan
un gran número de diferentes quitinasas y otras enzimas degradadoras de quitina (Svitil
et al., 1997; Sakai et al., 1998). Las enzimas quitinolíticas son generalmente inducidas
como un complejo multienzimático y están implicadas en la degradación de diversos
residuos que contienen quitina (Leger et al., 1996; Carrillo & Gómez, 1998).
De manera natural existen microorganismos con capacidad de producir enzimas que participan
en los procesos de biodegradación de substratos orgánicos como la quitina. Estos
microorganismos se encuentran tanto en ambientes acuáticos como terrestres (Yu, et al.
1991; Hunghming & Mah, 1992; Boyer, 1994; Chernin et al., 1995; Svitil, 1997; Carrillo
& Gómez, 1998). Vibrio harveyi y otras bacterias marinas pueden producir
diferentes quitinasas en respuesta a la forma de quitina que encuentran en su ambiente, lo
que implica su capacidad para distinguir diferentes tipos de quitina (Svitil et al.,
1997).
Actualmente, el estudio de microorganismos quitinolíticos ha cobrado gran importancia e
interés ya que ofrece una posibilidad potencial de aplicación en procesos de
biorremediación, en ambientes donde la sobre explotación de los recursos naturales ha
llevado a la acumulación de residuos hasta límites que exceden la capacidad de
degradación propia de la naturaleza, así como la posible aplicación de estos
microorganismos como biocontroladores de plagas agrícolas causadas principalmente por
hongos e insectos debido a que llevan quitina en sus estructuras (Skujins et al., 1965;
Boyer, 1994; Chernin et al. 1995; Leger et al. 1996).
El presente trabajo tiene por objetivo la comparación de consorcios de microorga-nismos
con actividad quitinolítica presentes en la rizósfera y sedimentos marinos, en relación
a sus características fenotípicas. Este estudio constituye una etapa inicial para la
selección de estirpes microbianas productoras de enzimas con potencial uso en
biotecnología (Shaikh & Deshpande, 1993).
Material y Métodos.-
TOMA DE MUESTRA:
Se trabajó muestras procedentes de ambiente marino y de suelo cultivado.
Se colectaron 2 muestras de sedimento a nivel de orilla y 2 de fondo (4 m de profundidad)
en la playa «Marbella», Callao, que fueron recogidas en frascos de vidrio estériles de
250 mL de capacidad con la ayuda de cucharas estériles y draga, respectivamente.
Las muestras de suelo agrícola fueron colectadas a nivel de rizósfera en un viñedo de
la localidad de "Grocio Prado" en Chincha, Ica. Las muestras se tomaron de 4
puntos diferentes y equidistantes y fueron recogidas con cucharas estériles y colocadas
en bolsas de primer uso.
Las muestras recogidas fueron transportadas en contenedores refrigerados.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS:
El recuento de microorganismos quitinolíticos fue realizado utilizando la técnica
estadística del Número Más Probable (NMP) con una serie de 3 tubos, para lo cual se
realizaron diluciones decimales en Solución Salina de hasta 10–4 para sedimentos
marinos y 10–5 para las muestras de rizósfera siguiendo las recomendaciones de Dutka
(1978) y APHA/AWWA/WPCF (1995).
El medio empleado para las muestras de origen marino fue el caldo Quitina Granulada (CQG),
preparado con agua de mar (Boyer, 1994) y para las de rizósfera fue el caldo Quitina
Coloidal (CQC) preparado con extracto de compost (Rodríguez-Kabana et al., 1983). Los
tubos se incubaron a temperatura ambiente por 8 y 18 días para tierra de rizósfera y
sedimentos marinos respectivamente. Los tubos que presentaron película y turbidez fueron
considerados positivos en la lectura.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS QUINOLÍTICOS:
Los tubos positivos se sembraron por estriado en agar Quitina Granulada (AQG) y agar
Quitina Coloidal (AQC) y las placas se incubaron a temperatura ambiente por 1 y 2 semanas
para las muestras de rizósfera y sedimentos marinos respectivamente. Las colonias
desarrolladas en los medios sólidos, fueron caracterizadas morfológicamente.
Para su conservación, las colonias en estudio fueron sembradas por puntura en viales con
agar Luria semisólido y mantenidas a temperatura ambiente.
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y FISIOLÓGICA:
Se estudiaron 36 colonias provenientes de ambientes marinos y 31 de rizósfera, las cuales
se reactivaron en caldo Luria por duplicado y se sembraron en medio Hugh y Leifson Glucosa
(Oxidación/Fermentación) para determinar los tipos metabólicos. Fueron realizados
también: coloración Gram, prueba de Motilidad en gota pendiente, coloración de flagelos
por el método de Leifson (Leifson, 1951) y producción de esporas; se realizaron además
las pruebas de Oxidasa y Catalasa.
ACTIVIDAD QUINOLÍTICA:
Los cultivos en Caldo Luria se sembraron por moteado sobre Agar Quitina Coloidal para
muestras de rizósfera y agar Quitina Granulada para el caso de muestras de agua de mar,
utilizando asa calibrada de 1 mm de diámetro. Las placas se incubaron a temperatura
ambiente por 9 días.
La actividad quitinolítica de las bacterias se evidenció por la formación de halos de
digestión enzimática.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO:
Los resultados obtenidos fueron analizados utilizando el programa NTSYS v. 1.7
("Numeral Taxonomy and Multivariate Análisis System"). Se elaboraron matrices
empleando el Coeficiente de Similaridad Simple (SM) y los elementos de éstas fueron
sometidos a análisis de agrupamientos con la técnica UPGMA ("Unweighted pair-group
method using averages") para la elaboración de los fenogramas.
Resultados.-
RECUENTO DE MICROORGANISMOS Y AISLAMIENTO:
Por medio de la técnica del NMP, se pudo comprobar que la mayor densidad de bacterias con
capacidad quitinolítica se encuentra en las muestras procedentes de rizósfera. En los
sedimentos marinos la mayor densidad de microorganismos quitinolíticos se ubicó en las
muestras de fondo en comparación con las de orilla (Tabla 1).
TABLA N° 1
Recuento de microorganismos quitinolíticos presentes en rizósfera de vid y sedimento
marino. |
MUESTRA |
Microorganismos
quitinolíticos
NMP/g |
| Rizósfera |
³ 16 x 104
³ 16 x 104
³ 16 x 104
³ 16 x 104 |
| Sedimento marinos |
a. Fondo
A
B |
16 x 103
78 x 10 |
b. Orilla
C
D |
22 x 10
33 x 10 |
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y
FISIOLÓGICA:
Luego de realizar las pruebas diferenciales básicas de los consorcios quitinolíticos
estudiados, se encontró que los microorganismos procedentes de rizósfera son
predominantemente Oxidasa(+) y Catalasa(+), en cambio los organismos de sedimentos marinos
son mayormente Oxidasa(–) y Catalasa (+). Las colonias aisladas de rizósfera en su
mayoría son inmóviles (87,4%), en cambio el 100% de los aislamientos provenientes de
sedimentos marinos fueron inmóviles (Tabla 2). La coloración de Leifson confirmó la
ausencia de estructuras flagelares en las cepas sin motilidad.
TABLA N° 2
Pruebas diferenciales básicas de las poblaciones quitinolíticas |
Prueba
d |
Rizósfera |
Sedimento
Marino |
Orilla |
Fondo |
n = 31 |
% |
n = 13 |
% |
n = 23 |
% |
| Producción de oxidasa |
19 |
61.3 |
3 |
23.1 |
6 |
26.1 |
| Producción de catalasa |
27 |
87.1 |
9 |
69.2 |
18 |
78.3 |
| Móviles |
7 |
22.6 |
0 |
0.0 |
0 |
0.0 |
Al realizar la coloración Gram se
encontró que las bacterias quitinolíticas estudiadas presentaban una gran variedad
morfológica (8 tipos morfológicos). Los consorcios procedentes de rizósfera fueron en
su mayoría bacilos Gram positivos (35,5%). En cuanto a los microorganismos
quitinolíticos procedentes de sedimentos marinos tenemos que: los que proceden de la
orilla fueron en su mayoría cocos Gram positivos (38,5%) y bacilos Gram negativos
(23,1%), mientras que los microorganismos procedentes del fondo fueron predominantemente
bacilos Gram positivos (52,2%). Los aislados procedentes de rizósfera exhibieron la mayor
diversidad de tipos morfológicos, un total de 7 (Tabla 3). No se encontraron organismos
esporulados en ambos consorcios.
TABLA N° 3
Variedad morfológica de microorganismos quitinolíticos presentes en rizósferas
y sedimento marino. |
Tipos
Morfológicos |
Rizósfera |
Sedimento
Marino |
| Orilla |
Fondo |
| n = 31 |
% |
n = 13 |
% |
n = 23 |
% |
I Cocos G (+)
II Cocos G (-)
III Bacilos G (+)
IV Bacilos G (-)
V Cocobacilos G (+)
VI Cocobacilos G (-)
VII Pleomórficos G (+)
VIII Pleomórficos G (-) |
8
1
11
0
3
4
2
2 |
25.8
3.2
35.5
0.0
9.7
12.9
6.5
6.5 |
5
1
2
3
1
1
0
0 |
38.5
77.7
15.4
23.1
7.7
7.7
0.0
0.0 |
5
0
12
2
1
1
2
0 |
21.7
0.0
52.2
8.7
4.3
4.3
8.7
0.0 |
Al evaluar el comportamiento de los
microorganismos quitinolíticos en relación con el metabolismo de la glucosa, encontramos
que los microorganismos procedentes de fondos marinos no siguen vías fermentativas,
mientras que sólo un 7,7% de los aislamientos de orilla son fermentadores anaerogénicos.
El consorcio quitinolítico de rizósfera está conformado en un 58% por microorganismos
no fermentadores de glucosa (Tabla 4).
TABLA N° 4
Comportamiento de los microorganismos quitinolíticos en relación al metabolismo
de la glucosa.
|
Metabolismo
de la Glucosa |
Rizósfera |
Sedimento
Marino |
| Orilla |
Fondo |
| n = 31 |
% |
n = 13 |
% |
n = 23 |
% |
No oxidadores no fermentadores
Oxidadores no fermentadores
Fermentadores anaerogénicos
Fermentadores aerogénicos
No crecieron em medio O/F |
9
9
6
7
0 |
29.0
29.0
19.4
22.6
0.0 |
7
2
1
0
3 |
53.8
15.4
7.7
0.0
23.1 |
7
7
0
0
9 |
30.4
30.4
0.0
0.0
39.2 |
ACTIVIDAD QUINOLÍTICA:
A los 9 días de crecimiento se comparó la actividad quitinolítica entre los
microorganismos procedentes de rizósfera y los procedentes de sedimentos marinos,
encontrándose que los primeros presentaban una mayor actividad quitinolítica, que se
evidenció por el rápido crecimiento de las colonias y la formación de halos de
digestión enzimática, mientras que la mayoría de cepas aisladas de sedimentos marinos
si bien crecieron, no formaron halo al cabo de ese tiempo (Tabla 5).
TABLA N° 5
Actividad quinolítica de los microorganismos seleccionados en rizósfera y sedimento
marino.
|
Actividad
Quinolítica
(9 días de cultivo) |
Rizósfera |
Sedimento
Marino |
| Orilla |
Fondo |
| n = 31 |
% |
n = 13 |
% |
n = 23 |
% |
Presencia de halo
Sin Halo |
18
13 |
58.1
41.9 |
1
12 |
7.7
92.3 |
0
23 |
0.0
100.0 |
ANÁLISIS DE LOS CONSORCIOS:
El análisis de agrupamiento de las características fenotípicas del total de aislados
estudiados nos permite observar que tanto los consorcios microbianos de sedimentos marinos
como de rizósfera tienen características comunes a un nivel de similaridad del 90%; se
distinguen, sin embargo, algunos grupos formados exclusivamente por organismos marinos o
de rizósfera unidos a un nivel de similaridad inferior al 85% (Figura 1). Al analizar
separadamente ambos consorcios (Figura 2 y Figura 3) podemos apreciar, a un nivel de
similaridad del 75%, 5 grupos en rizósfera y 2 en sedimentos marinos, lo que establece
una mayor variedad fenotípica en los primeros. No se observan diferencias entre las
poblaciones de orilla y sedimentos.
 |
Fig. 1:
Fenograma construido utilizando el coeficiente de similaridad de coincidencia simple y
agrupamiento UPGMA para poblaciones microbianas quitinolíticas de rizósfera de vi (cepas
R) y sedimentos marinos (cepas O y F). |
 |
Fig. 2:
Fenograma construido utilizando el coeficiente de similaridad de coincidencia simple y
agrupamiento UPGMA para poblaciones microbianas quitinolíticas de rizósfera de vid. |
 |
Fig. 3:
Fenograma construido utilizando el coeficiente de similaridad de coincidencia simple y
agrupamiento UPGMA para poblaciones microbianas quitinolíticas de sedimentos marinos. |
Discusión.-
La densidad microbiana quitinolítica en rizósfera es 2 unidades logarítmicas mayor que
la de fondos marinos, y 4 unidades mayor que la de sedimentos de orilla. Esto se podría
explicar por el hecho de que las raíces de vid exudan sustancias nutritivas,
principalmente azúcares, que permiten el incremento de microorganismos heterotróficos,
especialmente hongos que poseen una pared celular a base de quitina la que a su vez ofrece
un sustrato para bacterias quitinolíticas (Flach et al., 1992).
Las diferencias encontradas en los consorcios de los dos ambientes en cuanto a su
capacidad para la producción de la enzima Oxidasa, nos indicaría la disponibilidad en
ambos ambientes de bacterias distinguibles y potencialmente utilizables para la
biodegradación de la quitina. Las poblaciones estudiadas presentan escasa motilidad, lo
que nos permitiría suponer que estos organismos viven fundamentalmente adheridos a sus
substratos.
Se observa un predominio de tipos morfológicos Gram (+), tanto en suelo como en mar, lo
cual se explica por la facilidad que tienen éstos, en razón a la estructura de sus
envolturas celulares, para liberar al medio extracelular enzimas líticas como las
quitinasas. Se aprecia, además, una mayor diversidad de tipos morfológicos en
rizósfera.
En cuanto a la actividad metabólica, los microorganismos quitinolíticos mayormente
siguen vías oxidativas que son las que generan mayor cantidad de energía. En el caso de
las poblaciones marinas se observa también un porcentaje considerable de individuos que
no utilizan glucosa como principal fuente de carbono y energía, lo cual es comprensible
si consideramos al medio ambiente marino como oligotrófico en comparación con el
ambiente rizosférico (viñedos), que es un substrato rico en glucosa. Esta apreciación
es reforzada por la lentitud con la que las bacterias de ambientes marinos utilizan la
quitina. La quitinolisis en el piso del océano es una actividad microbiana sumamente
importante porque permite el mantenimiento de los niveles de C y N en el ecosistema marino
(Yu et al., 1991).
Si bien los consorcios marinos y de rizósfera tienen características comunes en un nivel
de similaridad bastante alto, considerando las pruebas incluidas en este trabajo, se
pueden distinguir algunos grupos formados exclusivamente por organismos marinos y otros de
rizósfera con una menor similitud, lo cual nos permite diferenciar microorganismos con
características propias dentro de cada ecosistema. La mayor variabilidad fenotípica
observada en el consorcio microbiano de rizósfera concuerda con las características de
este ambiente descritas anteriormente.
La presencia de una gran diversidad fenotípica en consorcios microbianos quitinolíticos
de ambientes terrestres y sedimentos marinos con características diferenciales justifica
la exploración de estirpes productoras de enzimas en ambos ambientes, lo cual puede
llevar a la selección y mejoramiento de cepas productoras de enzimas quitinolíticas,
así como la utilización del material genético en la construcción biotecnológica de
cepas que puedan utilizarse en procesos de biorremediación y de control biológico de
plagas.
Conclusiones.-
Se encontró que en las condiciones de ensayo en el laboratorio, la mayor densidad de
microorganismos quitinolíticos procede de las muestras de rizósfera de vid.
El consorcio quitinolítico de rizósfera es en su mayoría Oxidasa (+) y Catalasa (+), a
diferencia del consorcio de sedimentos marinos que es mayormente Oxidasa (–) y
Catalasa (+).
Los consorcios quitinolíticos estudiados exhiben una gran diversidad morfológica.
El comportamiento de los microorga-nismos quitinolíticos de rizósfera y de sedimentos
marinos en relación al metabolismo de la glucosa indica que la mayoría no sigue la vía
fermentativa.
El análisis de agrupamiento de los consorcios, si bien nos muestra una alta similaridad
entre fenotipos de sedimentos marinos y rizósfera en ambos ambientes, también permite
determinar microorganismos con características fenotípicas propias en cada uno de los
ecosistemas estudiados.
AGRADECIMIENTOS:
A la Biol. Rita Orozco Moreira del Inst. del Mar del Perú por su colaboración en la toma
de muestras, así como al Dr. Abad Flores Paucarima por las facilidades brindadas para la
realización del presente trabajo dentro del curso de Seminarios en Tópicos de
Microbiología y Parasitología.
Bibliografía
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* Lab. Microbiología Molecular. Fac. Cc. Biológicas, Univ.
Nac. Mayor de San Marcos. Aptdo.720, Lima 1, Perú. E-mail, d190001@unmsm.edu.pe
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