CARACTERIZACIÓN PARCIAL DEL VENENO DE LA SERPIENTE CASCABEL PERUANA Crotalus durissus terrificus

César Remuzgo, Miryam Paola Alvarez, Fanny Lazo y Armando Yarlequé*

INTRODUCCIÓN

La serpiente cascabel sudamericana Crotalus durissus terrificus pertenece a la subfamilia Crotalinae y es considerada la más peligrosa de las especies de este grupo en América. Se trata de un reptil corpulento que mide hasta 1,8 m y en el Perú está restringida a la provincia de Sandia, departamento de Puno (Meneses, 1974; Carrillo e Icochea, 1995). Debido a los numerosos accidentes reportados tanto en Norteamérica como en Brasil, se ha investigado ampliamente su veneno y se ha encontrado manifestaciones clínicas muy severas que van desde la coagulación sanguínea e hipotensión hasta transtornos renales y neurotoxicidad; este último efecto es el responsable de la muerte (Russell, 1983).

En 1938 se aisló una neurotoxina de este veneno, que fue denominada crotoxina (Slotta y Fraenket-Conrat, 1938-39), la cual se demostró posteriormente que estaba compuesta por una potente fosfolipasa A₂, y un péptido ácido asociado. Más adelante se han purificado otras neurotoxinas como la crotamina (Gongalves, 1956), convulxina (Prado-Franceschi y Brazil, 1981) y giroxina (Barrio, 1961); esta última es asociada a la enzima similar a trombina (Alexander et al., 1988).

Una observación interesante es la existencia de variaciones en la composición del veneno de una misma especie debido a diferencias geográficas, estación del año en que se colecta el veneno, edad de la serpiente y la dieta (Minton and Weinstein, 1986). Asimismo se ha encontrado que C. durissus terrificus de algunas regiones geográficas en Sudamérica sólo producen descenso de la presión sanguínea (Vellard y Huidobro, 1942).

Como es sabido, el ofidismo es un problema de salud que aflige principalmente a los pobladores de las zonas de selva y en el Perú, donde las serpientes venenosas corresponden a 33 especies algunas de las cuales se ubican en los valles interandinos y la costa (Carrillo e Icochea, 1995). Sin embargo, C. durissus terrificus sólo ha sido encontrada en la zona de Sandia y no se tiene mayor información sobre la composición de su veneno y sus efectos biológicos. Los estudios realizados por Cárdenas et al., 1995 con especímenes en cautiverio han permitido establecer la existencia de varias actividades enzimáticas con el propósito de establecer los principales factores que determinan el envenenamiento.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material Biológico.-

Se utilizó veneno de la serpiente cascabel C. durissus terrificus, colectado de dos especímenes procedentes de la provincia de Sandia (Puno), al sureste del Perú y mantenidos en cautiverio en el Serpentario "Oswaldo Meneses" del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. El veneno extraído y liofilizado fue almacenado a -8 °C.

Reactivos.-

Se utilizó Sephadex G-100, albúmina sérica bovina, L-leucina, o-dianisidina, peroxidasa de rabanito, Ioduro de acetiltiocolina, 4,4'-ditiodipiridina, Na-Benzoil-DL-Arginina-p-nitroanilida (BApNA), fibrinógeno bovino y caseína, los cuales fueron obtenidos de Sigma Chemical Company (St. Louis, USA). Los demás reactivos químicos usados fueron de grado analítico.

Determinación de proteínas.-

Se utilizó el método de Lowry (1951) y durante el fraccionamiento se midió la concentración de proteínas a 280 nm, usando como patrón a la albúmina sérica bovina.

Fraccionamiento Cromatográfico.-

Se aplicó 38 mg de veneno liofilizado disuelto en 1 mL de buffer acetato de amonio 0,1 M pH 6,0 a una columna de Sephadex G-100 (38,5 x 1,1 cm) eluida con el mismo buffer a una velocidad de flujo de 8,7 ml/h, colectándose fracciones de 2 mL.

Actividades Enzimáticas.-

• L-aminoácido oxidasa:
  
  Se determinó por el método descrito en el Worthington Enzyme Manual (Worthington Biochemical Corporation, 1977). La mezcla de reacción contenía: L-leucina 0,1% y o-dianisidina 0,0065% y peroxidasa de rabanito 0,005% en buffer Tris HCl 0,2 M pH 7,5; además de la fracción enzimática o el veneno total.
  
  La actividad se determinó por el incremento de la absorbancia a 436 nm.

• Acetilcolinesterasa:
  
  Fue evaluada por el método de Ellman et al. (1961). Para ello se empleó como substrato Ioduro de acetiltiocolina 25 mM, 4,4'-ditiodipiridina 1,25 mM en buffer fosfato 0,05 M pH 7,4. Al adicionarse la alícuota de veneno o la fracción correspondiente se midió el incremento de absorbancia a 324 nm.

• Fosfolipasa A₂:
  
  Se empleó solución lipoproteica (yema de huevo) al 45 % en buffer Tris HCl 10 mM con CaCl 2 10 mM a pH 7,5, midiéndose el retardo en el tiempo de coagulación luego de 15 minutos de incubación con la fracción o el veneno crudo (Vidal y Stoppani, 1971).

• Amidolítica:
  
  Se utilizó el substrato cromogénico Na-Benzoil-DL-Arginina-p-nitroanilida (BApNA) 9 x 10-4 M en buffer Tris HCl 0,1 M pH 8,1, midiéndose la aparición del color amarillo a 405 nm luego de agregar la fracción o veneno (Erlanger et al., 1961).

• Coagulante:
  
  Fue determinada usando 0,2 mL de fibrinógeno bovino 5 mg/mL en buffer fosfato salino 0,02 M pH 7,2, se agregó luego 0, 1 mL de veneno o fracción; registrándose el tiempo de coagulación en segundos (Copley et al., 1973).

• Proteolítica:
  
  La actividad proteolítica se determinó según el método de Kunitz, modificado por Takahashi y Ohsaka (1970), empleando caseína al 2% en buffer Tris HCl 0,2 M pH 8,5. Luego de agregar la fracción o veneno correspondiente, se midió la aparición de productos ácidos solubles a 280 nm.

Electroforesis.-

Los picos obtenidos fueron analizados por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras (Laemmli, 1970), utilizando como proteínas patrones albúmina bovina (66 kDa), ovoalbúmina (45 kDa) y fisozima (14,3 kDa). Las muestras se corrieron en un gel de resolución al 9,5% por una hora a 100 voltios. El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie 0,1%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El contenido de proteínas del veneno total de C. durissus terrificus fue del 68,6%. Este porcentaje es similar al encontrado en otras serpientes peruanas de la subfamilia Crotalinae como Bothrops pictus (63,8%) y Bothrops atrox (69,2%) (Cárdenas, 1995); sin embargo, posee un menor porcentaje con respecto a C. durissus terrificus de Argentina (81,4%) y de Brasil (76,9%) (Yarlequé 1987; Cárdenas, 1995).

Las actividades enzimáticas del veneno de C. durissus terrificus son mostradas en la Tabla 1; no se detectó, como puede observarse, la presencia de acetilcolinesterasa en las fracciones y el veneno crudo.

Hemos encontrado una baja actividad L-aminodcido oxidasa. Este resultado es coincidente con lo reportado para el veneno de C. durissus terrificus de Brasil y Argentina (Tan and Ponnudurai, 1992; Vidal et al., 1972). La enzima L-aminoácido oxidasa se encuentra presente en pequeñas cantidades en el veneno, ya que éste era de color blanco, y como es sabido posee como grupo prostético al FAD el cual le da la coloración amarilla a los venenos. Sin embargo, a veces esta serpiente puede producir veneno de color amarillo y otras veces de color blanco (Vidal et al., 1972). La acción biológica de esta enzima en el veneno no está determinada, aunque recientemente se ha reportado que posee una acción antibacteriana y posiblemente sea parte del mecanismo de protección (Yarlequé et al., 1997).

Por otro lado, los venenos que presentan alta actividad proteolítica se caracterizan por producir hemorragias, necrosis y severa lisis de las proteínas de los músculos; así los venenos crotálidos son más proteolíticos que los vipéridos y éstos que los elápidos. El veneno de C. durissus terrificus siendo un crotálido es poco proteolítico (Otero et al., 1992), lo que concuerda con nuestros resultados y los hallados para ponzoñas de esta especie de Argentina y de Brasil (Yarlequé, 1987; Cárdenas, 1995).

Igualmente La actividad fosfolipasa A₂ encontrada en este veneno es baja con respecto al veneno de otros crotálidos y de venenos de elápidos (Cárdenas, 1995); resultado similar fue reportado por Tan and Ponnudurai (1992). La presencia de esta actividad en el veneno es asociada al complejo crotoxina, lo que explica la nefrotoxicidad, la hemólisis intravascular por alteraciones en la membrana eritrocítica producidas por fosfolipasas de acción indirecta y el shock neurotóxico producidos durante el envenenamiento (Brazil, 1966).

En cuanto a la actividad coagulante, ésta es usualmente debida a la enzima similar a trombina, la que se caracteriza por poseer también actividad amidolítica y estar relacionada con la manifestación del síndrome giroxina en animales inyectados, donde se producen episodios temporarios caracterizados por opistotonos y rotaciones alrededor del aje axial (Alexander et al., 1988; Barrio, 1961). Su presencia explica los transtornos en la coagulación que se dan durante el envenenamiento (Russell, 1983).

El fraccionamiento cromatográfico del veneno crudo sobre una columna de Sephadex G-100 ha mostrado tres picos de proteína (Figura 1). En el primer pico y en el tercero encontramos la presencia de actividad proteolítica; la del primer pico es más activa que la del tercer pico. En el segundo pico encontramos la presencia de actividad amidolítica, coagulante y fosfolipasa A₂. No se pudo registrar la actividad L-aminoácido oxidasa (Tabla 1), algunos autores sugieren una progresiva inactivación de la enzima de pH 5,5 a 7,5 en el veneno de Crotalus adamanteus (Coles et al., 1980); sin embargo en nuestro caso esta situación aún no ha sido explorada.

Fig. 1: Cromatografía del filtración en gel sobre Sephadex G-100 del veneno de Crotalus durissus terrificus. (---) Actividad proteolítica.

El análisis electroforético en condiciones denaturantes de los picos obtenidos nos mostró un primer pico con la presencia de proteínas que migran en un rango de peso molecular de 54,2 a 103,3 kDa aproximadamente; el segundo pico mostró dos bandas de proteína con pesos moleculares aproximados de 22,5 y 14,8 kDa, y el tercer pico una prominente banda con proteínas con pesos moleculares posiblemente menores a 15 kDa (Figura 2). Aun cuando los electroferogramas nos han permitido una evaluación inicial del número de bandas proteicas en este veneno, es necesario variar algunas condiciones como, por ejemplo, aumentar el porcentaje de acrilamida para obtener una mayor resolución de dichas bandas.

Fig. 2: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio. Se utilizó un gel de resolución al 9.5%. 1 y 5: Marcadores de peso molecular; 2: Pico 1; 3: Pico 2; 4: Pico 3.

Una exploración más detallada de este veneno nos permitirá elucidar la acción biológica de sus componentes proteicos y su toxicidad en humanos; y, por otro lado, entender por qué esta especie se desarrolla en un hábitat tan estrecho y definido como la selva sudeste de nuestro país, teniendo en cuenta su amplia distribución en la selva de Brasil, Argentina y Bolivia.



Bibliografía

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* Laboratorio de Biología Molecular. ICBAR. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. E-mail:d190061@unmsm.edu.pe

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