| Revista Peruana de Biología
Vol. 6 • Nº 2 • 1999 |
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LA TÉCNICA DE PRECOLORACIÓN DE
WALKER PARA EVALUAR Plasmodium vivax Grassi Y Plasmodium malariae Laveran EN COMUNIDADES
ASHANINKAS EN SATIPO (JUNÍN, PERÚ)
José A. Iannacone O.1; Cecilia Caballero
R. & José A. Rentería
RESUMEN
Se evalué la técnica de precoloración de Walker en comparación con la técnica de
Giemsa clásica como método de diferenciación para las especies de Plasmodium vivax y
Plasmodium malaria, en 208 muestras de sangre de siete comunidades Asháninkas en el
distrito de Río Tambo, Satipo, Junín, Perú. La densidad parasitaria por el sistema de
cruces (+) y por parásitos/mL fue mayor en la técnica de precoloración de Walker. La
prevalencia del parásito en el total de muestras evaluadas fue: P vivax (24,52%) y P.
malariae (0,48%). De las siete comunidades evaluadas en el distrito de Río Tambo: Puerto
Ocopa, Unión Puerto Asháninka y Shimavenzo presentaron la mayor prevalencia de
infección con 42,42%, 27,27% y 27,27% respectivamente. Las edades de 0 a 10 años y 41-50
años presentaron la mayor prevalencia de infección con 31,30% y 40% respectivamente. La
prevalencia de infección por plasmodio fue independiente del sexo. La densidad de
parásitos/mL por ambas técnicas de diferenciación, fue mayor en la comunidad Puerto
Prado, pero estadísticamente independiente de los grupos etáreos y el sexo. Se analizan
las ventajas de la técnica de la precoloración de Walker y algunos factores que
influirían en las variaciones en la prevalencia de infección y densidad parasitaria de
los plasmodios en dependencia de las comunidades evaluadas, grupos etáreos y el sexo.
Palabras clave: Malaria, Plasmodium, diagnóstico parasitológico, comunidades
nativas.
ABSTRACT
The precoloration technique of Walker was assayed in comparation with the classic Giemsa
technique as a differential method to Plasmodium vivax and Plasmodium malariae, in 208
blood samples of seven Ashaninka communities from Rio Tambo district, Satipo, Junin, Peru.
Density of parasites by crossing system (+) and by parasites/mL were higher with
precoloration of Walker. The prevalence of the parasites was to P. vivax (24,52%) and P.
malariae (0,48%) of all samples assayed. Of the seven communities evaluated from Rio Tambo
district: Puerto Ocopa, Unión Puerto Ashaninka and Shimavenzo communities showed the
highest prevalence of infection with 42,42%, 27,27% y 27,27% respectively. The ages
between 0 to 10 and 41-50 years showed the highest prevalence of infection with 31,30% and
40% respectively. The prevalence of infection was independent with the sex. Density of
parasites/mL with both techniques were higher in Puerto Prado community; but statistically
independent with age and sex. The advantage of precoloration technique of Walker was
investigated and some factors that would influence variations in the prevalence of
infection and density of parasites of plasmodia assayed dependent on what communities were
sampled, age and sex.
Key words: Malarie, Plasmodium, parasitological diagnosis, native communities.
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La malaria o paludismo es una enfermedad tropical causada por un protozoario del genero
Plasmodium y transmitida por mosquito del género Anopheles; esta enfermedad es
extremadamente peligrosa y se encuentra distribuida en climas tropicales alrededor del
mundo (INS, 1996, Olliaro et al., 1996; Iannacone y Alvariño, 1997).
En el Perú, la malaria es una endemia nacional, con un patrón definido de comportamiento
temporal y estacional, cuya mayor incidencia generalmente se registra durante los seis
primeros meses del año, asociada geográfica y ecológicamente a zonas tropicales y
desérticas irrigadas de la costa norte, selva montañosa nororiental, selva centro
sudoriental y selva baja o llano amazónico oriental de nuestro país (MINSA, 1996).
En el Perú existen tres especies de Plasmodium capaces de infectar al hombre: Plasmodium
vivax Grassi, Plasmodium falciparum Welch y Plasmodium malariae Laveran. La mayor parte de
los casos registrados por el Ministerio de Salud (MINSA), corresponden a la infección por
P. vivax, aunque hace algunos años se viene incrementando el número de casos de
infección por P. falciparum, lo cual se asocia a una forma más crítica y grave de
malaria (OMS, 1988; Demarini et al., 1995; MINSA, 1995). En la vertiente nororiental de
los Andes y Llano amazónico (Loreto y Jaén), la especie predominante continúa siendo P.
vivax, pero se observa gradualmente un aumento de malaria por P. falciparum y por P.
malariae (Chapilliquen et al., 1993; MINSA, 1996).
El examen microscópico de muestras sanguíneas empleando la coloración Giemsa clásica
es un componente esencial para la vigilancia y control de la malaria en dreas rurales
(Payne, 1988; Tham et al., 1999). En la última década, la investigación de esta
enfermedad ha sido dirigida a la utilización de métodos para mejorar el diagnóstico de
la malaria (WHO, 1988; Tharavanij, 1990; Shiff et al., 1993; Jelinek y Grobush, 1999;
Kathleen y Zhong, 1999). Se han empleado muchas técnicas, entre ellas la microscopía
fluorescente, técnicas moleculares (<<PCR>>), prueba de captura rápida de
antígenos con tiras reactivas (ParaSight®-F), y por último técnicas inmunoenzimáticas
(Pammenter, 1988; Oliveira et al., 1996; Makler et al., 1998; Palmer et al., 1998). Sin
embargo, en nuestro país, estos procedimientos aún no se emplean en evaluaciones de
áreas endémicas, ni mucho menos en laboratorios de escasos recursos en zonas rurales
tropicales. Una alternativa viable en nuestro país es el empleo de la técnica de
precoloración de Walker, que modifica la coloración Giemsa clásica, mejorando la
observación microscópica; es de bajo costo, y permite una lectura a posteriori sin
pérdida de la forma y del color característico de los plasmodios, y además no requiere
un adiestramiento muy especializado (OMS, 1988).
El presente estudio tuvo como objetivos: 1) evaluar la eficacia de la técnica de
precoloración de Walker en comparación con el Giemsa clásico, como método de
diferenciación para las especies de P. vivax y P. malariae registrados en el distrito de
Río Tambo, Satipo (Junín, Perú), y 2) determinar la prevalencia de infección y
densidad parasitaria de los plasmodios encontradas en el distrito de Río Tambo, Satipo en
dependencia de las comunidades evaluadas, grupos etáreos y sexo.
MATERIALES Y MÉTODOS
SITUACIÓN GEOGRÁFICA DEL DISTRITO RÍO
TAMBO
El distrito Río Tambo, a 400 msnm, pertenece a la provincia de Satipo, departamento de
Junín, región Mariscal Andrés Avelino Cáceres, Perú. La capital del distrito de Tambo
es Puerto Ocopa. Este distrito tiene más de 20 comunidades entre nativos Asháninkas y
colonos residentes de la zona; se localiza aguas abajo de la confluencia de los ríos
Pangoa y Perené. Las siete comunidades seleccionadas para realizar el muestreo fueron
Puerto Ocopa, Gloriabamba, Puerto Prado, Unión Puerto Asháninka, Puerto Asháninka,
Shimavenzo y Samaniato (Figura 1).
TRABAJO DE CAMPO
- Número de muestras. El
número de muestras tomadas fue en total 208. El muestreo de campo se realizó durante
agosto y setiembre de 1997, distribuidas entre las siete comunidades en orden descendente
al número de muestras: Unión Puerto Asháninka (66), Samaniato (26), Puerto Ocopa (33),
Gloriabamba (22), Shimavenzo (22) Puerto Prado (20) y Puerto Asháninka (19).
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Figura 1.
Mapa de las siete comunidades Asháninkas muestreadas en el distrito de Río Tambo,
Satipo, Junín, Perú |
- Obtención de la
muestra. La obtención de las muestras se realizó a través de la técnica de la gota
gruesa, de acuerdo al procedimiento descrito por la OMS (1988). Se preparó dos clases de
películas de sangre, ]a gota gruesa y el frotís para su examen por microscopía directa,
ambas en una misma lámina. De cada comunero se tomaron cuatro láminas, de las cuales dos
fueron coloreadas con la técnica de precoloración de Walker al momento de la obtención
de la muestra y las dos láminas restantes fueron coloreadas con la técnica Giemsa
habitual de laboratorio, empleada por OMS (1988).
- Técnica de
precoloración de Walker. Esta técnica requiere del colorante azul de metileno (0,3%) y
de una solución amortiguadora (buffer fosfato). El porta-objetos se sumergió durante un
segundo en azul de metileno, y se eliminó el exceso del colorante; la lámina se
sumergió en la solución amortiguadora a través de cinco inmersiones suaves tratando de
obtener una superficie clara no azulada, y por último se procedió al secado de la
lámina a la temperatura ambiente.
- Criterios de
inclusión. Personas en estado febril, sexo masculino o femenino desde los tres meses de
edad hasta los 50 años.
- Criterios de
exclusión. Persona que se encuentre en calidad de visitante en cada una de las siete
comunidades muestreadas.
TRABAJO DE LABORATORIO
En el laboratorio se fijaron los frotises con metanol, se colorearon ]as cuatro, láminas,
se diagnosticaron al microscopio ]as muestras hemáticas, y finalmente se procedió a
determinar la densidad parasitaria a través de dos métodos: el sistema de cruces y el
número de parásitos por microlitro de sangre, (parásitos/µL)
- Diagnóstico de la
muestra hemática. Se identificó la especie de plasmodio presente en cada lámina, se
observaron los estadios característicos corno trofozoito joven, mediano, maduro,
esquizonte y gametocito. Se observaron las diferencias morfológicas puntuales entre P
vivax y R malariae en base al tamaño del núcleo, forma del citoplasma, pigmento
presente, número de merozoitos y tamaño del trofozoito maduro, etc., usando las claves
de la OMS (1987), con estas características se determinó la especie del plasmodio
presente en cada lámina.
- Determinación de la
densidad parasitaria. A través de dos métodos:
* Sistema de
cruces (+). Se sumó el total de parásitos de todos los estadios observados con igual
peso ponderado, en 100 campos microscópicos, siguiendo la siguiente escala:
1 Menos de 40
2 +/2 De 40 a 60 parásitos en 100 campos.
3 + Un parásito por campo en 100 campos.
4 ++ De 2 a 20 parásitos por campo en 100 campos.
5 De 21 a 200 parásitos por campo en 100
campos.
6 Más de 200 parásitos por campo en 100
campos.
* Número de parásitos
por microlitro de sangre (µL). Para realizar el conteo se necesitó de dos contadores
manuales, uno para contar los estadios de los parásitos con igual peso ponderado y el
otro para los leucocitos. Si después de contar 200 leucocitos, 10 o más parásitos han
sido identificados, se deja de realizar el conteo y si después de contar 200 leucocitos
se encontró 9 o menos parásitos se continúa contando hasta llegar a 500 leucocitos. El
número relativo de parásitos con el n6mero de leucocitos contados puede ser convertido a
parásitos por microlitro (µL) de sangre usando la siguiente fórmula:
Parásitos/µL = Número de parásitos x 8000
Número de leucocitos
* Análisis de datos
Se emplearon algunos métodos estadísticos de asociación: el coeficiente de correlación
de Pearson (r) se utilizó como indicación de la relación entre los grupos etáreos de
las personas muestreadas y el número de parásitos/µL con Giemsa clásico y con la
precoloración de Walker. Se usó este coeficiente para determinar la relación entre
grupos etáreos y la prevalencia de infección por plasmodios, con previa transformación
arcoseno de los datos de prevalencia. El efecto del sexo en la prevalencia de infección
se calculó usando la prueba de xI. El estadístico G, se utilizó para determinar si
existen diferencias en la prevalencia según grupos etáreos y comunidades muestreadas
(Zar, 1996). Para evaluar si existen diferencias entre el ndmero de parásitos/µL de
sangre entre el Giemsa clásico y la técnica de Walker, se usó la prueba de t de student
para datos pareados. Se utilizó el ANDEVA,.para determinar si existen diferencias
significativas en la densidad parasitaria/mL de sangre por ambas técnicas entre las siete
comunidades del distrito de Río Tambo y según grupos etáreos; para el primer caso, las
comunidades Puerto Asháninka y Samaniato se consideraron un solo grupo; y en el úlltimo
caso, se consideraron solo tres grupos de edades: 0-10 años, 11-20 años y 21-50 años,
por el reducido número de casos positivos. En el caso de existir diferencias
significativas se usó la prueba a posteriori de Tukey. Se calculó la prueba de t de
student para determinar si existen diferencias en la densidad parasitaria/µL según el
sexo de las personas muestreadas previa evaluación de la homogeneidad de varianzas
empleando la prueba de Levene. El nivel de significancia fue evaluado a a = 0,05 (Daniel,
1993). La terminología ecológica para la prevalencia y densidad parasitaria de
infección siguió los criterios de Bush et al. (1997). Para el cálculo de los
parámetros estadísticos descriptivos e inferenciales, se empleó el paquete estadístico
SPSS para Windows 95.
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Figura 2.
Densidad parasitaria de Plasmodium spp. con la precoloración de Walker y con la
coloración Giemsa clásica usando el sistema de cruces en comunidades Asháninkas de
Satipo, Junín, Perú. |
RESULTADOS
De las 208 muestras evaluadas se encontraron 52 muestras positivas a plasmodios, de los
cuales 51 muestras (98,08%) correspondieron a P vivax y una muestra corresponde a P.
malariae (1,92%), lo que indica que la presencia de P. malariae es escasa en comparación
con P. vivax. La prevalencia de las especies diagnosticadas en el distrito de Río Tambo
para P. vivax es 24,52% y para P. malariae es 0,48% del total de muestras evaluadas. El
resto de casos febriles correspondería a otros agentes etiológicos distintos de la
malaria.
Al comparar ]a densidad parasitaria hallada a través del sistema de cruces (+) de las
muestras tratadas con la precoloración de Walker y con la coloración Giemsa clásica, se
observó en las muestras con la precoloración una mayor densidad parasitaria,
incrementando notablemente en la escala 4 en un 160% y por ende, se reduce el número de
muestras de baja densidad en un 29,41 %. En las muestras con Giemsa clásico, se observó
un patrón opuesto (Figura 2).
La densidad parasitaria hallada a través del cálculo del número de parásitos por mL de
sangre mostró una mayor cantidad de parásitos en láminas tratadas con la precoloración
de Walker (2043,53 t 4631,45), comparada con láminas coloreadas solo con el Giemsa
clásico (1620,1 ± 3926,26) donde el número de parásitos encontrados fue menor (t =
2,88, P = 0,006, g.l. = 5 1) (Figura 3). Además, ambos procedimientos de coloración
están altamente correlacionados (r = 0,98, P = 0,001, n = 52). La frecuencia de
dominancia para la densidad de parásitos/µL, de las dos técnicas empleadas, en Giemsa
clásico fue superior en nueve casos (17,30%), la técnica de precoloración de Walker en
38 casos (73,07%) y una frecuencia compartida en cinco casos (9,61%).
La figura 4 describe el numero de casos de malaria positivos y negativos en las siete
comunidades del distrito de Río Tambo, Satipo, Junín. El número de muestras positivas
en las siete comunidades presentó el siguiente orden decreciente: Unión Puerto
Asháninka > Puerto Ocopa > Shimavenzo > Gloriabamba > Samaniato = Puerto
Prado > Puerto Asháninka. Unión Puerto Asháninka y Puerto Ocopa son las dos
comunidades que presentaron la mayor población en comparación con el resto de
comunidades visitadas. Existen diferencias en la prevalencia de infección entre las siete
comunidades de Río Tambo (G = 12, 06, P < 0,05, g.l.= 6). La prevalencia de los casos
de malaria en las siete comunidades de Río Tambo presentó el siguiente orden
decreciente: Puerto Ocopa (42,42%) > Unión Puerto Asháninka (27,27%) = Shimaenzo
(27,27%) > Gloriabamba (22,72%) > Puerto Prado (20%) > Samaniato (15,38%) >
Puerto Asháninka (5,26%). El ANDEVA indica que existen diferencias significativas en la
densidad parasitaria/µL de sangre para las siete comunidades, por la precoloración (F =
4,27, P = 0,003, g.l. = 5) y por el Giemsa clásico (F = 3,61, P = 0,008, g.l.= 5). Para
ambas técnicas de coloración, la prueba de Tukey indicó que Puerto Prado fue diferente
del resto de comunidades en relación al número de parásitos/mL (Precoloración = 10758
y Giemsa clásico = 8528).
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Figura 3.
Densidad parasitaria de Plasmodium spp. con la precoloración de Walker y la coloración
Giemsa clásica del sistema de parásitos/mL en comunidades Asháninkas de Satipo, Junín,
Perú |
Se observa que de los 52 casos positivos para malaria encontrados, de acuerdo a la edad,
47 casos (88,46%) corresponden a niños y jóvenes entre 0 a 20 años de edad el análisis
estadístico muestra que la presencia de malaria es dependiente de la edad (G = 13,97, P
< 0,05, g.l. = 4), lo que nos revela que los niños de 0 a 10 años (Prevalencia =
31,30%) y los adultos de 41 a 50 años (Prevalencia = 40%), representan la población más
susceptible a contraer esta enfermedad (Figura 5). Sin embargo, la edad de la población
muestreada no se encuentra correlacionada con la prevalencia de infección por plasmodio
(r = 0,05, P = 0,937, n = 5). Sin embargo el ANDEVA indica que el número de parásitos
por mL de sangre es estadísticamente igual tanto por la precoloración (F = 1,24, P =
0,29, g.l. = 2 y 49) como por el Giemsa clásico (F = 1,09, P = 0,34, g.l.= 2 y 49) con
relación a los tres grupos etáreos evaluados, aunque numéricamente el grupo etáreo de
0 a 10 años fue mucho mayor que los otros dos grupos, según ambas técnicas
(Precoloración = 2710,27± 5430) y (Giemsa clásico 2148,52 ± 4613) (Figura 6).
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Figura 4.
Número de muestras positivas de Plasmodium spp. en siete omunidades Asháninkas
de Satipo, Junín, Perú |
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Figura 5.
Número de muestras con Plasmodium spp de acuerdo a los grupos etáreos en las
comunidades Asháninkas de Satipo, Junín, Perú |
La presencia de los casos positivos de malaria en relación al sexo de los Asháninkas
muestra independencia en las comunidades del distrito de Río Tambo (X2 = 0,025, P >
0,05, g.l. = 1). Además, la prueba de t de student indica que no existen diferencias en
la densidad parasitaria/µl_ según el sexo, por la precoloración (t = 1,59, P 0, 11,
g.l. 50) y por el Giemsa clásico (t = 1,81, P = 0,07, g.l. = 50).
DISCUSIÓN
Durante 1996, se presentaron solo tres casos de P. malariae en el departamento de Junín,
lo que representa una prevalencia anual del 0,002% del total de casos evaluados (INS,
1997); sin embargo, este porcentaje podría incrementarse, pues en muchas ocasiones
algunos técnicos microscopistas lo confunden con R vivax, debido a la falta de
entrenamiento y experiencia. El resultado obtenido en este estudio; es una orden de
magnitud menor a la prevalencia para P. malariae de 0,06% para el Perú durante el año
1996. Bambaren et al. (1997) indican que durante 1996, en el distrito de Perené, Junín,
el 100% de casos fue por P. vivax y que el departamento de Junín corresponde a una zona
de alto riesgo para malaria. El estudio se realizó en época considerada de baja
transmisión de malaria, lo cual reforzaría la hipótesis de las presencia de recaídas
en algunas comunidades, en especial en Puerto Prado, el cual es un fuerte militar.
La mayor densidad parasitaria por el sistema de cruces (+) y por el número de
parásitos/mL de sangre, en las muestras tratadas con la precoloración de Walker en
comparación con el Giemsa clásico (Figura 2 y 3), se explica porque la precoloración
logró una óptima deshemoglobinización evidente con un fondo blanco y claro, y esto nos
permitió diferenciar la especie de plasmodio presente en la lámina, al observar los
colores y formas características del parásito en láminas de baja densidad, mejorando la
observación microscópica de las láminas coloreadas en comparación con la técnica de
Giemsa clásica, lo que disminuye los errores en el diagnóstico, ya sea por la identidad
de la especie o por láminas de baja densidad, sobre todo en laboratorios locales de
escasos recursos materiales y con pocas posibilidades de acondicionamiento para realizar
otras técnicas como la inmunofluorescencia, las moleculares, etc. Además evita la
fijación de la muestra, destinada sobre todo para zonas rurales donde el transporte al
laboratorio local toma tiempo, como es el caso del distrito de Río Tambo. En Satipo
(Junín), se presentan dos especies de plasmodio como son P. vivax y P. malariae; la
identidad de ambas especies conlleva a mucha confusión y error de lectura, dado que ambos
parásitos presentan una morfología muy parecida, no se diferencian ambas especies, sobre
todo si el microscopista no es experto y si tiene por limitaciones de un microscopio de no
muy buena resolución; esto tiene como consecuencia un tratamiento ineficaz.
Las diferencias encontradas en la prevalencia de infección por plasmodio, según las
siete comunidades muestreadas, fue mayor en Puerto Ocopa, Unión Puerto Asháninka y
Shimabenzo; estos resultados se deben según Kroeger y Alarcón (1993) a ligeras
diferencias con relación a la cercanía a criaderos de culícidos. En nuestro trabajo las
encuestas mostraron que miembros de una misma familia estaban infectados, debido
aparentemente a que los vectores vuelven a las mismas viviendas y el mismo vector pica a
diferentes miembros de una misma familia. Por otro lado, la población no usa mosquiteros,
lo que incrementaría la posibilidad de contacto con el vector intradomiciliariamente, a
pesar de no ser época de lluvias y, por lo tanto, se esperaría una menor densidad
poblacional vectorial; sin embargo, la prevalencia de infección por los plasmodios en
general es alta, inclusive si tornamos en cuenta que la población en cada una de las
siete comunidades no sobrepasa los 300 habitantes. Además, una de las mayores diferencias
en la prevalencia de infección entre las siete comunidades seria explicada por las
variaciones en los grupos etáreos y de sexo en las siete comunidades. Puerto Prado
presentó un mayor número de parásitos/mL en comparación con las otras seis
comunidades, debido a que toda la población evaluada correspondió a soldados jóvenes, a
quienes recién se les permitió realizarse un análisis de diagnóstico, al presentar
fiebres periódicas y con una fase muy avanzada de la enfermedad. El grado de
accesibilidad a las siete comunidades que se encuentran en un proceso de repoblamiento,
debido a los efectos del terrorismo, no influyó marcadamente en los resultados obtenidos,
pues Puerto Ocopa que es la más accesible y que presenta puesto de salud y Unión Puerto
Asháninka, que es la menos accesible, no presentaron en ningún caso diferencias
significativas.
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Figura 6.
Comparación de la densidad parasitaria de Plasmodium spp./mL por grupos etáreos
en las comunidaes Asháninkas de Satipo, Junín, Perú con la precoloración de Walker y
con la coloración Giemsa. |
En general, las comunidades por grupos etáreos siguieron uno de los tres patrones de
comportamiento, es decir, niveles descendentes de prevalencia de infección con la edad,
como sucede con un estudio realizado en La Campiña, Alto Piura, perú, cuyos valores
mayores suben entre 0-4 años y a 54 años de edad (Kroeger y Alarcón, 1993). Esto nos
indicaría una mayor proporción de infección intradomiciliaria. Bambaren et al. ( 1997)
en el distrito de Perené, Junín, Perú, indican que el grupo etáreo más afectado
correspondió a la población entre 15 a 44 años, atribuible a una mayor infección
extradomiciliaria. Nuestros resultados fueron opuestos a lo encontrado por estos autores.
El que no existan diferencias en la prevalencia y densidad parasitaria/µL de sangre con
el sexo de los individuos muestreados se explicaría porque no habría hábitos marcados
entre hombres y mujeres que originaran grupos con exposición al vector (Kroeger y
Alarcón, 1993; Castillo y Silva, 1997). Sin embargo, algunos estudios real izados,
también en selva baja como Madre de Dios, indican una mayor prevalencia de infección en
el sexo masculino (Kroeger y Alarcón, 1993).
Agradecimientos: A la Blga. Lorena Alvariño F., del Laboratorio de
Ecofisiología de la Universidad Nacional Federico Villarreal, Perú, por la revisión
critica del presente manuscrito. A la Blga. Cecilia Arce B. y a la Lic. en Tec. Med.
Blanca Pardavé L. de la División de Parasitología del Instituto Nacional de Salud,
Perú, por las sugerencias y apoyo brindado a la presente investigación. A los técnicos
José Reátegui L. y Deysi Valenzuela M. del Centro de Salud de Puerto Ocopa, Satipo,
Junín, Perú por su colaboración en el trabajo de campo con las comunidades Asháninkas.
Ver
bibliografía
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Laboratorio de Ecofisiología.
Área de Biodiversidad Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas. Universidad
Nacional Federico Villarreal. Calle San Marcos 383, Pueblo Libre, Lima 21-Perú.
E-mail: lorenal2@correo.dnet.com.pe
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