CARACTERIZACIÓN PARCIAL Y ESPECTRO ANTIMICROBIANO DE SUBSTANCIAS INHIBITORIAS PRODUCIDAS POR Alteromonas MARINAS

Jorge León¹ y Guillermina Tapia²

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos y, en particular, las bacterias han tenido un profundo efecto en el desarrollo de la química y las ciencias médicas. Desde el descubrimiento de la penicilina en 1929, estudios intensos principalmente de bacterias y hongos terrestres han revelado que los microorganismos constituyen una rica fuente de substancias bioactivas. A la fecha, se conocen entre 30 000 a 50 000 nuevos metabolitos provenientes de microorganismos, de los cuales más de 10 000 son compuestos biológicamente activos, y cerca de 8 000 tienen actividades antibióticas y antitumorales. Actualmente, más de 100 productos microbianos tienen uso clínico continuado como antibióticos, antitumorales y agentes agroquímicos (Fenical, 1993).

El estudio de antibiosis en bacterias marinas ha estado dirigido hacia la visualización del ambiente marino en su efecto autodepurador y al entendimiento de interrelaciones ecológicas de microorganismos en ambientes epífitos de macroalgas marinas (Gauthier, 1969; Andersen et al. 1974; Lemos et al. 1985). No obstante, Dopazo et al. (1988), León (1996) y León et al. (1997), frente a la gran capacidad antagónica de algunas cepas marinas sobre las bacterias patógenas de peces, encontradas en estudios, sugieren el uso potencial de las mismas en el biocontrol de epizootías en cultivos masivos de peces, moluscos y crustáceos. Por otra parte, Lodeiros et al. (1988) realizaron un estudio del potencial de producción de antibióticos por la flora bacteriana asociada a 13 monocultivos microalgales de utilidad en acuicultura, sugiriendo el posible uso profiláctico de ciertos monocultivos en sistemas de cultivo masivo de organismos marinos.

El mundo marino es una enorme fuente de recursos, y entre ellos los antibióticos producidos en forma natural podrían ser de gran utilidad en el control de enfermedades tanto en acuicultura como en patología humana. En este sentido, a través del presente trabajo se llevaron a cabo estudios básicos de extracción, caracterización bioquímica parcial y capacidades antibióticas de metabolitos inhibitorios producidos por bacterias marinas del género Alteromonas, seleccionadas por su alta capacidad antagónica frente a ictiopatógenos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Para la caracterización preliminar de substancias inhibitorias, se consideraron las cepas marinas signadas como N22.C y N11.6, pertenecientes al género Alteromonas, seleccionadas previamente por su amplio espectro antibacteriano frente a cepas testigo de laboratorio e ictiopatógenas.

CONDICIONES DE CULTIVO

El medio de cultivo para esta experiencia se preparo según la formulación de Gauthier (1976), y modificada por el autor con la adición de 0,1% de glucosa en lugar de 5% de almidón.

Se utilizaron como base 200 ml de Caldo Marino de ZoBell (CMZ) distribuidos en matraces de 500 ml, los cuales fueron inoculados con 1,0 ml de precultivos de 24 h de las cepas en prueba (10 células/ml). Los cultivos fueron incubados a la temperatura de 20 °C con agitación constante de 60 pulsos por min, hasta alcanzar la fase estacionaria a los 4 d.

EXTRACCIÓN DE LA SUBASTA INHIBITORIA

Para la extracción de productos antimicrobianos se utilizó básicamente el método descrito por Barja et al. (1989), con algunas modificaciones. La cepa marina cultivada en el medio CMZ en las condiciones indicadas fue centrifugada a 5 000 x g por 30 min. El pellet celular fue resuspendido en tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,1 para su posterior análisis.

Los sobrenadantes colectados fueron sometidos a precipitación fraccionada de proteínas con sulfato de amonio (Merck) hasta alcanzar 70% de saturación (Keen, 1966). Después de 14-16 h de mantenerlas a 4 °C, las muestras se centrifugaron a 5 000 x g por 30 min. El precipitado fue disuelto en agua destilada estéril. Esta muestra fue considerada "extracto crudo del sobrenadante" (ECS). En todos los casos, los "extractos crudos" fueron probados para determinar su actividad inhibitoria frente a la cepa testigo Staphylococcus aureus ATCC 11632.

FILTRACIÓN DE LAS COLUMNAS DE GEL SEPHADEX

La filtración en gel se realizó en columnas de Sephadex G-25 equilibrada con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,1) y 0,1M de NaCl, con un flujo de 60 ml/h (Barja et al. 1989). Para el proceso, se disolvió 0,5 g de ECS liofilizado en 2 ml de agua destilada para luego aplicar 1 ml a la columna. Las fracciones fueron recolectadas en volúmenes de 1 ml y luego determinadas las absorbancias para proteínas a 280 nm y su actividad inhibitoria frente a S. aureus ATCC 11632. Las fracciones activas de los eluídos fueron juntadas (5,0 ml), luego liofilizadas y mantenidas a -20 °C. Estas muestras fueron consideradas "semipurificadas" (SP).

ENSAYOS DE ACTIVIDAD INHIBITORIA

La actividad inhibitoria de las fracciones fue ensayada por dos métodos: el método de difusión en "pocillos" (Vignolo et al. 1993) y el método de difusión directa en placas (Naclerio et al. 1993). En ambos casos los métodos fueron adaptados para bacterias marinas. S. aureus ATCC 11632 y V. anguillarum NCMB 2133 fueron usados como cepas testigo, y Agar Tripticasa Soya (TSA) como medio de siembra.

Placas con medio TSA fueron cubiertas con 3 ml de una segunda capa de TSA semisólido (0,6% de agar) e inoculadas con 10 µl del cultivo testigo de 18 h de incubación. Luego de 30 min de difusión se crearon pocillos de 5 mm de diámetro e inoculados con 30 µl de la muestra en estudio. En el caso del segundo método se inocularon 10 µl de la muestra directamente sobre el cultivo. En ambos casos las placas fueron incubadas a 30 °C para el caso de V. anguillarum NCMB 2133 y a 35 °C para S. aureus ATCC 11632. Los resultados fueron observados a las 24 y 30 h mediante la formación de halos de inhibición.

EFECTO DE LA TEMPERATURA Y EL pH EN LA ESTABILIDAD DE LA SUBATANCIA INHIBITORIA

Para la prueba de termoestabilidad, la muestra "semipurificada" de la cepa N22C (50 mg) fue reconstituida en 400 ml de agua destilada, luego distribuida en tubos eppendorf (75 ml) y sometida a temperaturas crecientes (Baño Maria Memmert) de 50, 60, 70, 80 y 90 °C por 10, 15, 30 y 45 min. cada una. Luego del descenso de la temperatura a la ambiental, se inocularon 15 ml en el medio, TSA, previamente sembrado con S. aureus ATCC 11632 como cepa testigo. Para la lectura se consideró el diámetro de los halos de inhibición.

Para el ensayo del efecto de pH se empleó el Método de Bhunia et al. (1988). Las muestras semipurificadas, de las cepas en estudio (N11.6 y N22.C) fueron disueltas en agua desionizada estéril (50 mg/ml), luego distribuídas, en tubos eppendorf (100 ml) y ajustadas a pH distintos (2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; y 12,0) con soluciones de HCl y NaOH 10 mM. Después de 1,5 h de exposición las muestras tratadas fueron ajustadas a 7,0 de pH con una solución estéril de tampón fosfato 4 mM e inoculadas en placas conteniendo TSA sembradas con la cepa testigo.

ANTIBIOSIS COMPARATIVA DE UNA SUBATANCIA INHIBITORIA

La actividad antimicrobiana de la sustancia SP de la cepa N22.C se determinó mediante ensayos comparativos por el método de difusión en placas, según Baarn et al. (1966), con modificaciones del autor. Para el ensayo se utilizaron placas de TSA y cultivos de 18 h. Eluidos activos (10 ml) fueron comparados con la actividad de cinco, antibióticos de concentraciones conocidas (Sensidiscos, Merck). Como testigos se utilizaron cepas, de S. aureus ATCC 11632, V. anguillarum ATCC 19264, V. anguillarum NCMB 2133 yA. salmonicida 67.79.

RESULTADOS

PROCESOS DE EXTRACCIÓN DE LAS SUBSTANCIAS INHIBITORIAS

Trabajos previos y ensayos preliminares con las cepas marinas en estudio, mostraron evidencias, de que las substancias inhibitorias son de naturaleza proteica. Asimismo, los ensayos preliminares sobre antibiosis, mostraron que las substancias inhibitorias eran secretadas hacia el medio extracelular. Por lo tanto, los sobrenadantes de los cultivos se procesaron precipitando con concentraciones crecientes de sulfato de amonio, hasta una saturación de 70%.

Según el perfil de eluciones de la cepa N22.C, existe cierta correlación entre la absorbancia de los eluidos a 280 nm y la actividad antibacteriana frente a S. aureus ATCC 11632 (Fig. 1). Pruebas de actividad frente a V. anguillarum NCMB 2133 mostraron también fuerte inhibición en las fracciones 5, 6, 7, y 8 de los eluidos, (Fig. 2).

Figura 1 Perfil de elución y actividad inhibitoria en S. aureus ATCC 11632 de las fracciones obtenidas por precipitación con sulfato de amonio (0-70% saturación) en columnas de Sephadex G- 25 del ECS de Alteromas cepa N22.C. Cada fraccióm corresponde a 1 ml del eluido

Fig 2. Actividad inhibitoria sobre V. anguillarum NCMB 2133 de las fracciones 5-8 del extracto crudo del sobrenadante (ECS) de Alteronomas N22.C, filtradas por columnas de Sephadex G-25.

ACTIVIDAD INHIBITORIA DE "EXTRACTOS CRUDOS DEL SOBRENADANTE

Los extractos crudos del sobrenadante (ECS) cepas en estudio presentan un amplio rango de actividad inhibitoria contra bacterias patógenas de peces y moluscos (Tabla 1). Todos los patógenos ensayados fueron inhibidos por las sustancias crudas. El patógeno, de mayor sensibilidad resultó ser Vibrio ordalii NCMB 2167 (halo de inhibición de 18 mm de diámetro), seguida por V. anguillarum RP-13 (14 mm), Vibrio alginolyticus A32 (13 mm), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (14 mm) y Aeromonas hydrophila B-35 (13 mm).

Tabla 1. Espectro de actividad inhibitoria de los "extractos crudos" de las cepas N11.6 y N22.C del género Alteromonas frente a bacterias ictiopatógenas

CEPAS PATÓGENAS	SUBSTANCIAS DE:
	N 11.6	N22.C
Vibrio tubiashii FX1	++(a)	+
Vibrio anguillarum NCMB 2133	+	++
Vibrio anguillarum RP-13	+++	+++
Vibrio anguillarum 775	++	+
Vibrio ordalii NCMB 2167	++++	++++
Vibrio ordalii 84/2559	+++	++
Vibrio damsela ATCC 33539	+	+
Vibrio alginolyticus A32	++	+++
Aeromonas hydrophila B-35	++	+++
Aeromonas salmonicida 67.79	++	++
Aeromonas sobria P-281	+	+
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	++	+++
Yersinia ruckeri PP-31	++
(a) +, <8 mm zona de inhibición; ++, 8-12 mm zona de inhibición; +++, 12-16 mm zona de inhibición; +++, > 16 mm zona de inhibición. (b) cepa control

ESTABILIDAD DE LA SUBSTANCIA SEMIPURIFICADA FRENTE A LA TEMPERATURA Y pH

Pruebas de termosensibilidad (pérdida de actividad inhibitoria) entre 50 y 60 °C hasta por 45 min no alteraron la actividad de la substancia en estudio. A 70 °C por 45 min se observa una ligera sensibilidad de la muestra; a 80 °C por 30 min la sensibilidad es mayor y a los 45 min se produce pérdida de actividad. Finalmente a 90 °C a diferentes tiempos se observó mayor sensibilidad, aunque la pérdida total de actividad fue a los 45 min (Tabla 2), (Fig. 3).

Tabla 2. Efecto de la temperatura en la estabilidad de la substancia SP de Alteromonas cepa N22.C.

Tiempo (min)	Temperaturas (°C)
	50	60	70	80	90	Control(a)
10	15(b)	14	14	13	13	15
15	14	14	13	12	12	15
30	14	14	12	8	5	15
45	14	13	10	5	-	15
(a) S, aureus ATCC 11632; (b) halos de inhibixión en mm

 

	A
	B
Figura 3. pruebas de termosensibilidad de la substancia SP de Alteromonas N22.Cfrente a S. aureus ATCC 11632; en A, por 30 min y en B, por 45 min.

 

Respecto a la acción de diferentes niveles de pH, la substancia inhibidora de la muestra SP permanece estable dentro del rango de 5,0-9,0 y parcialmente sensible a pH 4,0 y 10,0; pero pierde actividad a valores extremos de pH 2,0 y 11,0 (Tabla 3).

Tabla 3. Efecto de pH en la estabilidad de la substancia SP de Alteromonas cepas N11.6 yN22.C

Muestra	pH
	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
N11.6	-	-	+	+	++	++	++	++	(+)	-	-
N22.C	-	(+)	+	+	++	++	++	++	(+)	-	-
(+): actividad aparente; +: actividad débil; ++: actividad definida

ACTIVIDAD ANTIBIÓTICA COMPARATIVA DE LA SUBSTANCIA SEMIPURIFICADA

En la Fig. 4 se muestran ensayos comparativos del efecto inhibitorio de la substancia SP (cepa N22.C) y antibióticos con concentraciones conocidas frente a V. anguillarum NCMB 2133 **. El efecto inhibitorio de la cepa N22.C (10 ml) es medianamente considerable si se compara con los antibióticos comerciales. La concentración de proteínas en los 10 ml de la muestra SP con actividad inhibitoria fue estimada, según Brown et al. (1989), en 36 mg. Los ensayos comparativos de la substancia SP con soluciones de oxitetraciclina (OTC), frente a V. anguillarum NCMB 2133, V. anguillarum ATCC 19264 y A. salmonicida 67,79, revelaron resultados similares en actividad inhibitoria (Tabla 4). La efectividad de la substancia SP (10 ml) fue similar a la solución de OTC de 30 ppm en los tres casos.

Fig. 4. Actividad antibiótica comparativa de la subatancia SP de Alteromonas N22. C frente a Vibrio angullarum NCMB 2133. V, vibramicina (30 mg); L, lincomicina (2 mg); PIP, ácido pipemídico (20 mg); n neomicina (30 mg); N22. C, (10 ml).

 

Tabla 4. Actividad antibiótica comparativa de la substancia SP de Alteromonas cep N22. C

Antibióticos	V. anguillarum	V. anguillarum	A. salmonicida
	NCMB 2133	ATCC 19264	67,79
Lincomicina (2 mg)	-	-	NP
Vibramicina (30mg)	35(a)	16	NP
Neomicina (30 mg)	16	18	NP
Ac. Pipemídico (20 mg)	22	20	NP
Subst. SP de N22.C (10 ml)	10	12	12
Oxitetraciclina (30 ppm)	10	13	12

DISCUSIÓN

Estudios de purificación y caracterización de las substancias inhibitorias producidas por bacterias marinas demuestran que pueden ser variables en cuanto a su naturaleza molecular. Burkholder et al. (1966) determinaron la naturaleza química de substancias antibacterianas producidas por cepas bacterianas marinas como compuestos bromopirrólicos, mientras que Gauthier (1976) y Gauthier & Flatau (1976) aislaron compuestos macromoleculares polianiónicos extracelulares de Alteromonas citrea, A. rubra y A. luteo-violaceus. Lemos et al. (1985) y Dopazo et al. (1988) aislaron compuestos inhibitorios polianiónicos extracelulares de Alteromonas. Ballester et al. (1977) aislaron y caracterizaron substancias antibióticas de alto peso molecular, en tanto que Bada et al. (1989) purificaron y caracterizaron substancias antibacterianas, producidas por Alteromonas cepa P-31; ésta fue una macromolécula glicoproteíca termolábil de 90 000 Da, con amplio espectro de actividad antimicrobiana. Así también, Riquelme et al. (1996) aislaron una cepa de Alteromonas haloplanktis con actividad inhibitoria contra vibrios patógenos de moluscos, cuya naturaleza se sugiere como un compuesto proteináceo.

En el presente trabajo se ha caracterizado parcialmente la substancia inhibitoria semipurificada encontrada en el extracto crudo extracelular (sobrenadante) de cultivos de Alteromonas spp cepa N22.C. Los resultados obtenidos son concordantes con los mostrados por Barja et al. (1989) y Riquelme et al. (1996). La(s) substancia(s) inhibidora(s) sólo fue(ron) parcialmente fraccionada(s) con concentraciones crecientes de sulfato de amonio hasta una saturación de 0-70%, por lo que se asume que tiene naturaleza proteinácea. Otros ensayos de caracterización revelaron que la substancia inhibitoria producida por la cepa N22.C es termosensible a 90 °C en 45 min y se mantiene estable dentro de un amplio rango de pH (3,0 a 9,0). Asimismo, la actividad antibiótica de la substancia semipurificada es comparativamente equivalente a 30 ppm de oxitetraciclina en pruebas de antibiosis frente a Vibrio anguillarum NCMB 2133.

La substancia inhibitoria secretada por Alteromonas sp cepa N22.C mostró su mayor actividad antagónica en la fase estacionaria (datos no presentados), y con ello adopta el comportamiento de un metabolito secundario. Esta característica junto con la naturaleza proteinácea y actividad antibacteriana de amplio espectro son concordantes con los resultados obtenidos por Lemos et al. (1985), Dopazo et al. (1988) y Riquelme et al. (1996) en otros aislados marinos del género Alteromonas.


Ver referencias

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1. Microbiología Ambiental y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.
2. Lab. Bioquímica, Facultad de Ciencias básicas, Carrera de Bioquímica, Universidad Católica de Valparaíso, Chile.

 

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