Bothrops brazili, conocida comúnmente como "Jergón Shushupe" (1) es una serpiente ponzoñosa que pertenece a la familia Viperidae, subfamilia Crotalinae. Habita en América del Sur, reportando su presencia en Brasil, Colombia, Ecuador, Guyana, Perú, Surinam y Guayana Francesa (2). En nuestro país se distribuye en los departamentos de Amazonas, Loreto, Madre de Dios y Ucayali. Esta serpiente presenta foceta loreal, importante órgano termoreceptor, lo cual es una característica taxonómica de las especies de la subfamilia Crotalinae. Además tiene contextura robusta, con una longitud promedio de 1,20 m. El dorso de estos animales es de color pardo con dibujos oscuros en forma de triángulo, los cuales tienen manchas en su vértice. El vientre es de color crema y se le ubica frecuentemente en la floresta primaria. Sus alimentos principales son roedores y lagartijas. Tienen fecundación interna y reproducción ovovivípara (3). Se conoce que la característica más importante del Bothrops brazili es la de producir abundante cantidad de veneno en sus glándulas en comparación con otros vipéridos (4), calculándose que puede inyectar hasta 4 mL de veneno en una mordedura. Por ello, un caso de ofidismo causado por Bothrops brazili tiene graves consecuencias, tanto por los componentes tóxicos presentes en su veneno como por el volumen que puede inocular.

Se sabe que la sintomatología de un envenenamiento botrópico, es decir, aquel accidente causado por especies del género Bothrops, tiene las siguientes características: dolor intenso en la zona afectada, hemorragia, formación de edema, descenso de la presión arterial, aparición del síndrome de coagulación intravascular diseminada, hemólisis y posterior necrosis. Estas alteraciones, cuando el accidente es causado por Bothrops brazili, pueden ser más graves, especialmente en cuanto a la hemorragia; de allí que el tratamiento clínico debe ser rápido y adecuado para atender estos casos.

Escobar y col, en 1996 (5), reportaron la presencia de una enzima proteolítica con acción sobre fibrinógeno y efecto hemorrágico, la cual estaba presente en el veneno de B. brazili. Por su parte, Azañero y col, en 1996 (6), estudiaron dicha enzima, encontrando que tenía acción sobre la fibrina y el fibrinógeno, llamándola enzima fibrinogenolítica. El estudio de esta proteína en cuanto a su acción hemorrágica fue sólo explorativo. Se define la hemorragia como la ruptura de las paredes de los vasos sanguíneos por compuestos llamados factores, principios hemorrágicos o hemorraginas (7), produciendo la salida de sangre en los vasos dañados. Las hemorraginas atacan las células endoteliales de los vasos sanguíneos, degradan las proteínas de los componentes de la lámina basal como de la matriz extracelular (8). Muchas hemorraginas degradan dichos vasos sanguíneos con patrones patológicos celulares similares, como la destrucción de la membrana plasmática, la desorganización de la lámina basal, entre otros (9,10). Como consecuencia de ello, la víctima sufre un desequilibrio local o sistémico (11). Debido a las importantes funciones que realiza la sangre, la hemorragia es uno de los síntomas más severos que se presenta durante un cuadro de ofidismo, siendo tan grave que por sólo esta causa una persona puede fallecer, puesto que la falta de meta-bolitos y especialmente la carencia de oxígeno produce daños irreversibles en órganos vitales.

Por tanto, el motivo de la presente investigación fue caracterizar la hemorragina aislada de B. brazili y determinar si el suero antibotrópico polivalente es capaz de neutralizarlo.

El veneno de B. brazili fue obtenido de especímenes procedentes de la zona del Alto Marañón, departamento de Amazonas, y mantenidos en el Serpentario "Oswaldo Meneses" del Museo de Historia Natural de la UNMSM.

La concentración de proteínas fue estimada alternativamente por la D.O. a 280 nm en un espectrofotómetro Shimadzu y por el método de Lowry et al. (12) usando albúmina sérica bovina como proteína estándar. La actividad proteolítica fue determinada por el método de Takahashi y Ohsaka (13), usando como substrato caseína al 2% en buffer Tris HCl 0,2M a pH 8,5. Los productos ácido solubles obtenidos por acción enzimática fueron medidos a 280 nm.

La actividad hemorrágica se llevó a cabo inoculando por vía intraperitoneal ratones albinos de 20-22g soluciones de 0,1 mL de veneno crudo y de la hemorragina purificada, siguiendo el método de Kondo (14) modificado por Lomonte et al (15). Luego de dos horas, los ratones fueron sacrificados, determinándose el área hemorrágica formada, para lo cual se midió el diámetro mayor de cada área. La dosis mínima hemorrágica (DHM) correspondió a la cantidad de muestra que produce un área hemorrágica de 10 mm de diámetro obtenida al graficar las dosis de muestras en escala logarítmica versus el diámetro de las áreas producidas expresadas en milímetros.

La purificación de la hemorragina se realizó de acuerdo con la técnica desarrollada por Azañero y col (6). Para ello se preparó una muestra que contenía 50 mg/mL de veneno de Bothrops brazili en buffer acetato de amonio 0,05M a pH 7,0, removiéndose los restos insolubles por centrifugación a 4 000 rpm por 15 minutos. La fracción soluble fue aplicada a una columna de filtración molecular en Sephadex G-100 (17,9 x 2,1 cm) equilibrada con el mismo buffer, colectándose fracciones de 2 mL. En cada fracción se determinó la absorbancia a 280 nm y la actividad sobre caseína. Las fracciones del segundo pico con mayor actividad proteolítica fueron juntadas y aplicadas a una columna de CM-Sephadex C-50 (14,6 x 1,2 cm) equilibrada con el mismo buffer, aplicándose después de dos volúmenes de buffer inicial una solución de cloruro de sodio 0,3M y luego a 0,6M para desprender la proteína asociada al sistema. En cada fracción se midió la actividad proteolítica y la acción hemorrágica. El pool que contenía a la hemorragina aislada fue sometido al análisis electroforético en PAGE-SDS para determinar la pureza de la preparación de acuerdo con la técnica de Weber y Osborn (16).

Con respecto a las propiedades de la proteína en estudio, el contenido de carbohidratos asociados a la hemorragina fue analizado por el método de Winzler, (17) para hexosas y hexosaminas, habiéndose usado el método de Warren (18) para la determinación de ácido siálico.

La estabilidad térmica de la proteína fue evaluada en un rango de temperatura de 37 a 70°C. Para ello se preparó alícuotas de 0,5 mL de muestra, incubándose los tubos por 10 minutos a 37, 50, 60 y 70°C. Luego de que las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se midió la actividad hemorrágica con 0,1 mL equivalente a 10 ug de la hemorragina.

Para observar el efecto del pH, se tomó una muestra de hemorragina 0,5 mL en buffer acetato de amonio 0,05M pH 7,0 y se la colocó en una bolsa de diálisis, efectuándose este procedimiento por 12 horas a temperatura ambiente con tres cambios de solvente, que en este caso fue buffer acetato de amonio 0,1M pH 5,0. Luego se determinó la actividad usando 22 ug de proteína. Así mismo, se evaluó la capacidad de hemorragina para hidrolizar ésteres sintéticos, como p-Tosyl arginil metil éster (TAME) y el colágeno bajo la forma de azocoll. En el primer caso, se incubó 3 mL de TAME 0,12 mM en buffer Tris HCl 0,05M pH 7,5 con 0,1 mL de la proteína en estudio y luego se siguió espectrofotometricamente el incremento de absorbancia a 247 nm, de acuerdo con la técnica de Schwert y Takenaka (19). En el segundo caso se usó 1,9 mL de azocoll (2mg/mL) en buffer Tris HCl 0,1M pH 8,0 y 0,1 de muestra (1mg/mL). La muestra se incubó a 37°C por 20 minutos y luego se añadió 1 mL de ácido tricloroacético 0,44M para medirse la absorbancia a 520 nm, siguiendo el método de Chavira et al (20) modificado por Rodríguez y Yarlequé (21).

La actividad específica fue expresada en unidades por minuto por mg de proteína. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima capaz de liberar grupos azo equivalente a una unidad óptica de 0,001 por minuto a 520 nm.

En cuanto a la influencia de algunos agentes químicos sobre la actividad hemorrágica, se utilizó concentraciones 5mM de EDTA, mercaptoetanol, ácido glutámico, glutatión, así como de los iones divalentes (Ca+2, Mg+2, Mn+2 y Zn+2) bajo la forma de cloruros. Mezclas que contenían cada uno de los agentes más la hemorragina (14 ug) fueron preincubadas a 37°C por 10 minutos, después de lo cual se determinó la actividad hemorrágica en cada muestra.

Adicionalmente, se efectuó ensayos para probar la antigenicidad de la proteína aislada. Para ello se realizó pruebas de inmunodifusión usando agarosa al 1% en buffer Veronal 0,08M pH 8,2 (22).

En láminas portaobjetos se colocó 3 mL de agarosa y luego se hizo agujeros de 3 mm de diámetro y en los agujeros periféricos se colocó 2 ul de hemorragina (0,370 mg/mL), veneno crudo (10 mg/mL) y albúmina bovina (0,1 mg/mL), respectivamente, mientras que en el agujero central se colocó 2 uL del suero antibotrópico polivalente (concentrado) preparado por el INS-Lima. Luego de colocar las láminas en cámara húmeda a temperatura ambiente por 22 horas, ellas fueron secadas a 50°C, teñidas con azul brillante de Coomasie 0,5% y decoloradas con metanol-ácido acético hasta visualizar las líneas de precipitación.

Para los ensayos de inmunoelectroforesis, se preparó láminas con agarosa al 1% y en cada lado de la lámina se hizo perforaciones de 1 x 4 mm, colocándose 2 uL de la hemorragina (0,370 mg/mL) y el veneno crudo (10 mg/mL), respectivamente, para luego someterlo a una corrida electroforética por una hora con una intensidad de corriente de 6 mA por hora. Inmediatamente después se hizo una canaleta central de 56 x 1 mm, en donde se colocó el suero antibotrópico polivalente, procediéndose a dejar las láminas en cámara húmeda durante 48 horas. Luego de lo cual se las coloreó con azul brillante de Coomasie al 0,5% y se efectuó la decoloración, tal como el caso anterior, para determinar las áreas de precipitación.

Finalmente, la hemorragina fue sometida al análisis de neutralización in vivo con el suero antibotrópico polivalente. Para ello, se preparó preincubados que contenían 10 uL de suero con 18, 36, 54 ug de veneno crudo y en paralelo con 10 ó 20 ug de hemorragina. Luego de la preincubación por una hora a 37°C, se tomó volúmenes de 0,1 mL que fueron inyectados por vía intraperitoneal a ratones albinos para medir la actividad hemorrágica en cada caso. La dosis de neutralización del suero antibotrópico Instituto Nacional de Salud (INS)-Lima indican que 10 mL del antiveneno neutralizan 32 ug de veneno botrópico.

Aislamiento de la hemorragina de Bothrops brazili

Las Figuras 1 y 2 resumen el procedimiento cromatográfico que permitió la purificación de la hemorragina en estudio, habiéndose usado la medida de la actividad caseinolítica para seguir su acción. Esta proteína se obtuvo en la cromatografía de filtración sobre Sephadex-G-100 en el segundo pico, y luego de pasar esta fracción por CM-Sephadex C50 a pH 7,0 la proteína hemorrágica fue recuperada al adicionarle al buffer de corrida NaCl 0,3 M.

Usando ambos pasos cromatográficos, se obtuvo una purificación de 8,4 veces, un rendimiento de 97,5% y se recuperó 5,006 mg de proteína activa, equivalente a 11,64% de la proteína total (Tabla 1). Así mismo, empleando la técnica de PAGE-SDS en presencia de 2-mercaptoetanol, se demostró que la hemorragina era una entidad homogénea constituida por una sola cadena polipeptídica. Por otro lado, la determinación de la dosis hemorrágica mínima (DHM), efectuada tanto en el veneno crudo como en la proteína aislada, dió valores de 6,17 ug y 6,61 ug, respectivamente.

Presencia de carbohidratos

En la Tabla 2 se muestra los datos obtenidos al medir cuantitavamente los carbohidratos asociados tanto al veneno crudo como a la hemorragina. Se puede apreciar que el porcentaje de hexosas para la proteína purificada fue de 8,05%, mientras que para hexosaminas fueron 11,62% y 0,69% para ácido siálico. En cambio, en el veneno crudo se obtuvo valores porcentuales de 0,99% para hexosas, 0,79% para hexosaminas y 0,24% para ácido siálico. Por tanto, podemos decir que la proteína hemorrágica es una glicoproteína básica.

Estabilidad a la temperatura y el pH

Los ensayos en animales de experimentación mostraron que la actividad hemorrágica se reduce en un 50% aproximadamente al incubarse la proteína a 50ºC por 10 minutos en lugar de 37ºC. En cambio, temperaturas de 60 y 70ºC, respectivamente, anularon la acción hemorrágica.

Así mismo, la proteína hemorrágica fue estable a pH 7,0 durante 6 semanas a temperatura ambiente, pero se inactivó completamente en 1 hora al colocarla en un medio ácido de pH 5,0.

Efecto de agentes químicos

El tratamiento con el agente quelante EDTA, el ácido glutámico y el glutatión a concentraciones de 5 mM produjeron una inhibición total de la hemorragina, tanto en su capacidad para hidrolizar la caseína como para inducir hemorragia en ratones albinos. En cambio, la adición de 2-mercaptoetanol o de los iones divalentes ZN+2, Mg+2 y Mn+2 no afectaron la actividad de la proteína. En contraste, los iones Ca+2, aún cuando no incrementaron el área hemorrágica, sí produjeron mayor intensidad en el sangrado (Tabla 3).