Cinética de Autooxidación del Ascorbato por Iones Cúpricos Luzmila Troncoso, Emilio Guija 1
Palabras claves: Ácido Ascórbico, Cobre, Radicales Libres, Óxido-Reducción, Antioxidantes. Cinetic of ascorbate-autooxidation mediated by Cupric ions Summary Ascorbate autooxidation catalized by Cu-II, occurs trough a first order reaction, process Cu-II-concentration-dependent and which fulfill saturation cinetic rules. It suggests that there may be the formation of an intermedial complex in the catalitic sequence, which probably limited the formation of reaction products; one of them is free radical hydroxil. Autooxidation reaction is notably inhibitted by thiourea, while glicerol have no effects. Disulfure-bindings on DNTB is not break by ascorbate and Cu-II, used in the same concentrations which occurs in autooxidation process. Histidine ald citrate inhibits both, autooxidation reaction and DNTB-disulfure binding break. These results suggests that the DNTB-disulfure binding-break is mediated by hydroxil free radicals, generated by the Asc/Cu-II system, and at the same time, through a reduction or hydrolitic process. Key words: Ascorbic Acid, Copper, Free Radicals, Oxidation-Reduction, Antioxidants. INTRODUCCIÓN El ascorbato es una vitamina que se encuentra ampliamente distribuída en frutas y verduras (1,2), pero no es sintetizado por el hombre, por cuyo motivo es imprescindible que lo incluya en su dieta (3). Existen diversos estudios que atribuyen al ascorbato un papel fundamental en las reacciones de hidroxilación, como un enérgico agente reductor biológico y con papeles bien definidos en la síntesis de carnitina y esteroides, la absorción de hierro no hem, la formación de colágeno, la función inmune y el metabolismo de nucleótidos cíclicos, aminoácidos, colesterol, glucosa y ácido fólico (4-7). El ácido ascórbico en presencia de trazas de metales de transición, como el Cu2+, genera radicales hidroxilo a través de un proceso de autooxidación (8). La presencia de EDTA inhibe esta reacción, debido a que forma un complejo con el Cu2+ (8). Cuando el ascorbato se encuentra en presencia de una concentración micromolar de Cu2+, incrementa considerablemente la oxidación de diversos compuestos biológicamente importantes, tales como las proteínas (9-11), polisacáridos (12) y ácidos nucleicos (13,14). La lipoperoxidación es estimulada cuando el ácido ascórbico se encuentra en presencia de sales de cobre o hierro, reacción que se produce con la formación de especies reactivas como son los radicales libres hidroxilo; pero en contraposición a ello, el ascorbato tiene la capacidad de conferir una eficiente protección contra la peroxidación lipídica (15,16) y en ese contexto puede restaurar las propiedades antioxidantes de la vitamina E oxidada, lo que podría constituirse en una de las funciones mas importantes de esta vitamina (17). La formación de peróxido de hidrógeno que se observa en el ojo es muy probable que se eleve debido a la oxidación no enzimática del ascorbato (18). El efecto que eventualmente puede ejercer el ascorbato es dependiente de su concentración, y en tal sentido puede comportarse como un eficiente antioxidante o en su defecto actuar como un prooxidante (19,20). Cuando las concentraciones de ascorbato se encuentran por encima de 1 mmol, actúa como un prooxidante en presencia de metales de transición, tales como Fe3+ y Cu2+ (21,22). Esta vitamina tiene la propiedad de reducir los puentes disulfuro de compuestos de origen biológico, así como de aquellos obtenidos por síntesis. La reducción del ácido 5,5' ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) por el sistema ascorbato/Cu2+, se incrementa considerablemente en presencia de cistina (23), en cambio, la presencia de superóxido dismutasa o catalasa ocasiona una disminución considerable de la ruptura del puente disulfuro del DTNB (8). En el presente trabajo se describe el proceso cinético de autooxidación del ascorbato y la probabilidad de que la ruptura de puentes disulfuro se realice exclusivamente por acción de radicales libres.
MATERIAL Y MÉTODOS Materiales En el manejo experimental se utilizaron ácido 5,5' ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) e histidina (Sigma Chemical Company), fosfato monopotásico, glicerol, citrato, sulfato de cobre (E. Merck Darmstadt), ácido ascórbico y tiourea (Riedel de Haen). Todas las soluciones se prepararon con agua bidestilada en vidrio. Métodos Reacción de autooxidación Las soluciones de ascorbato y las de DTNB se prepararon inmediatamente previas a la ejecución de cada experimento. La autooxidación del ascorbato se determinó midiendo la disminución de la absorbancia a 265 nm (24) utilizando para los cálculos un coeficiente de extinción molar de 19 300 M-1 cm-1, valor que obtuvimos experimentalmente en nuestro laboratorio. El medio de reacción contenía, en un volumen final de 3,0 mL, tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 8,0, ascorbato (3,3x10-5 M) y concentraciones diversas de Cu2+ u otras sustancias motivo de experimentación. La reacción se realizó a temperatura ambiente y se inició mediante la adición del Cu2+, la modificación de la absorbancia se midió en un graficador acoplado a un espectrofotómetro Gilford modelo 240. Ruptura del enlace disulfuro El ácido 5,5' ditiobis (2-nitrobenzoico) es un compuesto que por escisión de su puente disulfuro libera tionitrobenzoato que absorbe a 412 nm (25). El medio de ensayo contenía en un volumen de 2,0 mL, tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 8,0, ácido 5,5' ditiobis (2-nitrobenzoico) 1 mM y concentraciones variables de ascorbato y Cu2+. La liberación del tionitrobenzoato se midió a 412 nm en un espectrofotómetro Gilford modelo 240 acoplado a un graficador, y se cuantificó utilizando un coeficiente de extinción molar de 13 600 M-1cm-1.
RESULTADOS El ascorbato es una vitamina que en medio acuoso y en presencia de oxígeno sufre un proceso de autooxidación que es acelerado a pH alcalino por metales de transición. La autooxidación del ascorbato se siguió midiendo la disminución de la absorbancia a 265 nm en un medio de reacción ajustado a pH 8,0 al que se le adicionó concentraciones diferentes de Fe3+, Co2+ o Cu2+. La autooxidación del ascorbato en ausencia de los metales de transición antes mencionados, fue muy baja. En la Tabla N° 1 se observa que el ascorbato se autooxida en presencia de Cu2+ en un grado notablemente mayor que cuando se utilizaron los metales Co2+ o Fe3+, los que, en concentraciones dos veces mayores que el Cu2+, produjeron una muy discreta autooxidación del ascorbato.
El efecto ocasionado por el Cu2+ se pudo observar al utilizar concentraciones de este metal comprendidas entre 3,33 y 13,4 µM, este proceso se realiza a través de una reacción de primer orden. Cuando se grafican las constantes de velocidad de primer orden en función de las concentraciones de Cu2+, se observa que esta dependencia no es lineal, sino que corresponde a una curva de naturaleza hiperbólica, resultado que sugiere una cinética de saturación, tal como se muestra en la Fig. N° 1, donde es posible apreciar que el valor máximo de la concentración de Cu2+ que hemos utilizado para calcular la constante de velocidad corresponde a 0,0134 mM. La regraficación de los resultados anteriormente obtenidos en doble recíproca permite obtener una recta, lo que indicaría que la generación de radicales libres es saturable con respecto a la concentración de Cu2+, de lo que también se desprende el hecho que durante el proceso de autooxidación se forme un complejo intermedio. Estos resultados se ajustarían a la siguiente ecuación: donde: k’ = constante de velocidad
observada.
El valor de la constante de velocidad de primer orden en la saturación es igual a 0,045 seg-1 y fue calculada a partir del valor en el intercepto de la regraficación en doble recíproca, mientras que la constante aparente de disociación corresponde a 4,07 x 10-3 M. En el gráfico competitivo que se muestra en la Fig. N° 2, se observa que la tiourea, compuesto que tiene la propiedad de captar radicales libres, inhibe la autooxidación del ascorbato, proceso que es lineal en las condiciones experimentales descritas, habiéndose calculado a partir del mencionado gráfico una constante de protección de 1,75 x 10-4 M.
La utilización del glicerol con el mismo propósito, permitió observar que la autooxidación del ascorbato en presencia de Cu2+ no sufre alteración alguna, tal como se muestra en la Figura N° 3.
Cuando se utilizaron concentraciones de Cu2+ 1,34 x 10-5 M y ascorbato 3,3 x 10-5 M, que son las que se usaron para el proceso de autooxidación, no fue posible escindir el puente disulfuro del ácido 5,5' ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB); en cambio, si se incrementa la concentración de ascorbato a 2,0 mM manteniéndose la de Cu2+ a una concentración 0,01 mM, la liberación de tionitrobenzoato, que es el compuesto que se produce como consecuencia de la ruptura del puente disulfuro del DTNB, ocurre a una velocidad de 1,5 µM/min.
La presencia de histidina o citrato en el medio en que el ascorbato se autooxida por acción del Cu2+, ocasionó una notable inhibición, siendo mayor el efecto producido por la histidina. Un efecto similar se obtuvo cuando los compuestos anteriormente mencionados estuvieron presentes en una concentración 0,5 mM en el medio donde se produce la ruptura del puente disulfuro del DTNB por acción del sistema ascorbato/Cu2+.
DISCUSIÓN Diversos estudios sobre la cinética de oxidación del ascorbato catalizada por cobre, permitieron formular inicialmente un mecanismo que incluye una interacción entre el ion ascorbato y el ion cúprico, hecho que facilita la transferencia interna de un electrón. El ion cuproso formado es oxidado por el oxígeno molecular, y la forma de semiquinona del ascorbato, por el oxígeno y los iones cúpricos (26). La autooxidación del ascorbato por metales de transición ha sido descrita por diversos autores (27, 28), este proceso se realiza conjuntamente con la reducción del oxígeno molecular por un electrón y la formación de radicales libres hidroxilo (8). Los resultados mostrados en la Fig. N° 1 sugieren que en este proceso de autooxidación se formaría un complejo intermedio que limitaría dicha reacción, lo que está corroborado por la regraficación en doble recíproca. También se ha mostrado que la oxidación del ascorbato se estimula ligeramente en presencia de Fe3+, reacción que muestra un marcado incremento cuando se adiciona EDTA, y es inhibida en forma muy discreta por la superóxido dismutasa; estas observaciones permiten sugerir que el ascorbato es oxidado por el complejo EDTA/Fe3+, lo que estaría acorde con un incremento del potencial rédox del ion férrico cuando forma complejo con el EDTA (29). Nuestros resultados son similares a las observaciones descritas anteriormente, conforme se aprecia en la Tabla N° 1, la presencia de Fe3+ o Co2+ ocasionó una discreta autooxidación del ascorbato, en comparación con aquella producida por el Cu2+. Siendo el pKa del ascorbato 4,25, significa que a pH fisiológico la forma predominante corresponde al anión ascorbato, compuesto que oxidativamente forma ácido dehidroascórbico, proceso que ocurriría mediante la oxidación reversible con la formación de un compuesto intermedio de radical ascorbilo (30). Las propiedades antioxidantes del ascorbato tienen relación con la baja reactividad que tiene el radical semidehidro-ascorbato (31, 37). El efecto ejercido por la tiourea en el sentido de inhibir la autooxidación del ascorbato por el Cu2+, probablemente haya sido ocasionado por la propiedad que tiene este compuesto para ligarse a metales (32), también existe la posibilidad de que la tiourea reaccione con el peróxido de hidrógeno que se forma en la secuencia de reacciones que se produce durante la autooxidación del ascorbato, aunque no debe descartarse la alta afinidad que tiene la tiourea por el ion cuproso, cuya oxidación permite la generación de radicales hidroxilo (33), resultado que es similar a la inhibición ejercida por este compuesto sobre la hidroxilación del salicilato por acción del ascorbato, Cu2+ y peróxido de hidrógeno. El gráfico de competición lineal mostrado por la tiourea, sugiere que este compuesto compite con el ascorbato en el proceso antes descrito, en cambio el glicerol no ejerció efecto alguno, pero sí fue capaz de inhibir considerablemente la ruptura del enlace disulfuro del DTNB (34). La modificación selectiva de un residuo de histidina de la angiotensina I, se produce en condiciones en las cuales el ascorbato reacciona con cantidades catalíticas de Cu2+. El daño oxidativo que dicho sistema ocasiona al péptido se realiza específicamente en la posición C-2 del anillo imidazólico del residuo de histidina del péptido. Nuestros resultados tienen cierta correlación con los anteriormente descritos, ya que la presencia de histidina en el medio de reacción de autooxidación produce una notable inhibición del proceso. Tanto el ascorbato como el Cu2+ y la histidina son compuestos que normalmente se encuentran en los alimentos y en las células del organismo (35). No ha sido posible encontrar evidencias de la formación del radical superóxido durante el proceso de autooxidación del ascorbato, la acción inhibitoria mostrada por la superóxido dismutasa era probablemente debida al efecto de la molécula proteica de la enzima, y no a la remoción del radical superóxido (36). Ciertos autores han indicado que la ruptura del puente disulfuro del DTNB por el sistema ascorbato/Cu2+ se realiza exclusivamente por acción de los radicales libres hidroxilo (8), ya que en presencia de catalasa o manitol se produce una notable inhibición. El hecho que la ruptura del puente disulfuro del ácido 5,5' ditiobis (2-nitrobenzoico) no ocurra en las mismas condiciones experimentales en que se autooxida el ascorbato, permite sugerir que dicha escisión se produce no solamente por efecto de los radicales libres generados por el sistema ascorbato/Cu2+, sino que debe operar otro mecanismo en forma paralela, tal como la reducción o la hidrólisis; lo que también estaría sustentado por el efecto inhibitorio que ejerce el glicerol sobre la ruptura del enlace disulfuro del DTNB, asi como por el hecho de no afectar en forma alguna la autooxidación del ascorbato.
AGRADECIMIENTO El presente trabajo fue financiado por el
FEDU (Fondo Especial de Desarrollo Universitario), Proyectos N° 4240005 y 5240112.
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