SOBRE-EXPRESIÓN
DE LA PROTEÍNA P53 EN LA DISPLASIA CERVICAL
ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO EN 55 CASOS DEL HOSPITAL
REGIONAL DE APOYO DE ICA.
Dra. Guerrero
Alva Ivonn*,
Dr. Castilla Torres Faustino**.
. RESUMEN
.
INTRODUCCIÓN
.
MATERIALES Y MÉTODOS
.
RESULTADOS
.
DISCUSIÓN
RESUMEN
Objetivo: mutaciones del gen supresor de tumor y como consecuencia acumulación de la
proteína p53 resulta común en eventos tempranos o tardíos en el proceso de
carcinogénesis de un gran número de tumores malignos, entre los que se incluyen las
neoplasias genitales. En el presente estudio se evalúa la expresión de la proteína p53
en la displasia cervical y se relaciona la frecuencia de esta proteína en la displasia
leve, moderada y severa como probable marcador en los eventos de progresión de la
displasia en la carcinogénesis cervical.
Materiales y métodos: Se estudiaron las biopsias del cuello uterino de 55 mujeres con
diagnóstico de displasia cervical, 26 de las cuales correspondieron a displasia leve
(DL), 24 a displasia nioderada (DM) y 5 a displasia severa (DS), todas las muestras fueron
analizadas simultáneamente por inmunohistoquímica (IHQ) para detectar inmunoreacción de
la proteína p53. Un casofue considerado positivo cuando se observó una clara
inmunoreacción nuclear en las células displásicas como en el control positivo.
Resultados: La sobre-expresión de la proteína p53 fue demostrada en el 27.27% de los 55
casos estudiados, observándose inmunoreacción positiva en el 30.77% de las displasias
leves, en el 25% de las displasias moderadas y en el 20% dc las displasias severas.
Conclusiones: La detección inmunohistoquímica de la sobre-expresión de la proteína p53
en este grupo de displasias nos sugiere su relación con los eventos tempranos en el
proceso de carcinogénesis del cuello uterino, siendo necesario su posterior estudio
molecular que nos permita demostrar la mutación y polimorfismo de p53 en el codón 72 en
estas displasias, para determinar su rol indicador de la naturaleza maligna de la lesión
como marcador en la prevención del cáncer cervical.
Palabras clave: p53, displasia.
SUMMARY
Objective: p53 tumor suppressor gene mutations and as consequence accumulation of p53
protein is common in early or later events in the carcinogenetic process of high number of
malignant tumors, between them are included the genitals neoplasm.
In the present study we evaluated the expression of p53 protein in the cervical dysplasias
and related the frequency of this protein in low, moderate and severe dysplasias as
probable marker in the progression events of the dysplasias in the cervical
carcinogenesis.
Materials and Methods: we studied the uterine cervix samples of 55 women with diagnosis of
cervical dysplasia, 26 of them corresponded to low dysplasia (LD), 24 to moderate
dysplasia (MD) and 5 to severe dysplasia (DS), all the samples were analyzed
simultaneously for immunohistochemistry (IHC) to detect p53 protein immunoreaction. A case
was considered positive when we observed a clear nuclear immunoreaction in dysplasic cells
as the positive control.
Results: The p53 protein over-expression was showed in 27.27% of 55 cases studied,
observing positive immunoreaction in 30.7% of the low dysplasias, in 25% of moderate
dysplasias and in 20% of severe dysplasias.
Conclusion: The immunohistochemistry detection of the p53 protein over expression in this
group of dysplasias us suggest its relation with early events en the carcinogenesis
process of the uterine cervix, being necessary posterior molecular study of the p53 to
shower the mutation and p53 polymorphism at codon 72 in these dysplasias, to determine its
role indicating of the malignant nature of the lesion as probable marker in the cervical
cancer prevention.
|
El gen supresor de
tumor está localizado sobre el cromosoma l7p 13.1 y su producto codificado es una
fosfoproteína nuclear de. 53 kDa involucrada en el control del ciclo celular. Más
específicamente, las funciones de la proteína tipo salvaje detiene a las células en la
fase G1-S del ciclo celular cuando el ADN está dañado, permitiendo entonces la
reparación celular del ADN o muerte celular programada. La mayoría de los frecuentes
eventos moleculares en la oncogénesis humana son mutaciones del gen p53, permitiendo la
transformación neoplásica por pérdida de sus funciones. Mutaciones en el gen p53
también resultan en una proteína p53 de vida media prolongada, la cual llega a ser
detectada en el núcleo de la célula por inmunohistoquímica, mientras que el tipo
salvaje tiene una vida media muy corta en células normales y no es detectable. Una
variedad de tumores humanos que involucran p53 mantienen peor pronóstico que aquellos
tumores del mismo tipo que contienen el gen del tipo salvaje, como por ejemplo en
cánceres de mama, de riñón y colo-rectal. (9)
Mutaciones de p53 comúnmente ocurren en carcinomas de vejiga (2, 7, 1) y ha sido
reportada una asociación entre alteraciones p53 y pacientes recuperados. En el tumor
superficial, una asociación entre la sobreexpresión de la proteína p53 y una tendencia
hacia la progresión fue reportada por Sarkis et al (5). Sin embargo en otros estudios,
alteraciones de p53 fueron reportadas no teniendo valor pronóstico adicional al estadío
o grado de la lesión, esas discrepancias son probablemente debido a las diferencias en
los métodos usados para detectar sobre-expresión de p53 por IHQ o mutaciones del gen p53
por métodos moleculares. En la patogénesis del carcinoma de células escamosas, han
sugerido una correlación inversa entre infección por papilomavirus humano y mutación
del antioncogen p53, mucho menos se conoce de la posible correlación en el caso de
adenocarcinomas de la cerviz uterina. Mutaciones en el gen p53 han sido vistas entre el 10
- 31 % del cáncer al cuerpo del útero, con gran frecuencia de mutaciones en estadíos
avanzados de la enfermedad y/o histología desfavorable del tumor (4).
La presente investigación tuvo como objetivos: primero determinar por inmunohistoquímica
la frecuencia de la sobre-expresión de la proteína p53 en la displasia cervical y
segundo correlacionar esta frecuencia observada en displasia leve, moderada y severa,
evaluando además el rol en la progresión de las displasias hacia una lesión de mayor
grado en el cuello uterino.
Se estudiaron biopsias de
displasia del cuello uterino de 55 pacientes diagnosticadas en el departamento de
patología del Hospital Regional de Apoyo de Ica entre los años 1988 - 1998.
Correspondiendo 26 de ellas a displasia leve, 24 a displasia moderada y 5 casos a
displasia severa. El estudio inmunohistoquímico de la proteína p53 y análisis de los
resultados se realizó en la unidad de biología molecular del Centro de Investigación en
Cáncer Maes-Heller del Instituto de Enfermedades Neoplásicas "Dr. Eduardo Cáceres
Graziani".
El diagnóstico anátomo-patológico fue realizado por el mismo patólogo en las muestras
coloreadas con hematoxilina-eosina de todos los casos.
Material biológico-
Se realizaron cortes de 5 micras de espesor de los tejidos incluidos en parafina
correspondiente a cada caso en estudio. Los cortes fueron depositados sobre láminas
previamente tratadas con el fijador poly 1- lisina, y sometidas a los procesos ya
conocidos de desparafinación e hidratación de los tejidos.
Inmunohistoquímica-
Cada uno de los casos fue sometido a un pool de anticuerpos marca Dako aplicando el
método de peroxidasa anti peroxidasa. El anticuerpo monoclonal primario específico para
anti-p53 derivado de la clona DO-7 fue aplicado en una dilución 1:20. La inmunoreacción
fue revelada con diaminobenzidina. Se consideraron controles positivos y negativos
conocidos en el estudio.
Inmunotinción-
El patrón de distribución que determinó la presencia de la proteína p53 fue granular,
de color marrón y de localización intranuclear, teniendo como referencia controles
positivos conocidos trabajados simultáneamente con los casos del estudio. Se consideró
como caso negativo aquel que presentó escasas 2 o 3 células positivas o el que no
presentó inmunotinción.
Se estudió la
sobre-expresión de la proteína p53 empleando el método inmunoenzimático peroxidasa
anti peroxidasa en biopsias de tejido incluidas en parafina proveniente de 55 pacientes
con diagnóstico de displasia de la cerviz uterina.
El 47.27 % de los 55 casos lo constituyeron las displasias leves, el 43.63% (24 casos) la
displasia moderada y el 9.09% (5 casos) la displasia severa (tabla 1). En el 27.27%
(15/55) de las displasias se observó sobre-expresión del gen supresor de tumor p53. En
las displasias leves observarnos p53+ en 8/26 casos 30.77% (tabla 2), en las displasias
moderadas en 6/24 (25%) (tabla 3) y en 1/5 (20%) de las displasias severas (tabla 4). En
tres de los casos de displasia moderada y en uno de displasia leve observamos
hiper-expresión de la proteína mutada.
Caudro 1
Inmunoreacción del gen de tumor p53 vs grados de displasia
|
| Grado de displasia |
n° |
% |
n° p53+ |
% |
| Leve |
26 |
47.27 |
8 |
53.33 |
| Moderada |
24 |
43.64 |
6 |
40.00 |
| Severa |
5 |
9.09 |
1 |
6.67 |
| Total |
55 |
100.00 |
15 |
100.00 |
Cuadro 2
Frecuencia deminmunoreacción de p53 en displasia leve
|
| |
D. leve |
% |
| p53+ |
8 |
30.77 |
| p53- |
18 |
69.23 |
| Total |
26 |
100.00 |
Caudro 3
Frecuencia de inmunoreacción de p53 en displasia moderada
|
| |
D. moderada |
% |
| p53+ |
6 |
25.00 |
| p53- |
18 |
75.00 |
| Total |
24 |
100.00 |
Caudro 4
Frecuencia de inmunorreacción de p 53 en displasia severa
|
| |
D. severa |
% |
| p53+ |
1 |
20.00 |
| p53- |
4 |
80.00 |
| Total |
5 |
100.00 |
Interpretación de la
inmunoreacción.- Un caso fue considerado positivo cuando el porcentaje de células
displásicas con reacción intranuclear color marrón, indicativa de la sobre-expresión
de la proteína p53, en nuestro estudio correspondió hasta el 50% de ellas y más del 50%
en los casos de hiperexpresión. Las células inmunoreactivas en cada caso fueron
claramente identificadas al microscopio.
La mayoría de los
carcinomas cervicales parecen progresar a partir de la neoplasia intraepitelial cervical.
Además de la infección con papilomavirus humano de alto riesgo, el cual es indicativo de
un riesgo incrementado de progresión, las alteraciones de oncogenes y genes supresores de
tumores como el gen p53 juegan un rol importante.
La proteína p53 es considerada como una proteína multifacética por la diversidad de
funciones que parece cumplir en la célula a pesar de tener un tiempo de vida media corto
de aproximadamente 30 minutos, tiempo suficiente para cumplir un importante rol
transcripcional y controlar el ciclo celular. Las mutaciones que presenta el gen p53 se
han traducido actualmente en sinónimo de neoplasia por ser el evento que caracteriza a la
mayoría de los cánceres en humanos, entre los que también incluyen el cuello del
útero, de ahí el interés nuestro de investigar en este grupo de displasias. Se ha
observado que en el modelo del cáncer al colon aproximadamente el 80% de ellos presenta
pérdida de ambos alelos del gen p53 y las mutaciones puntuales generalmente sin sentido
aumentan el riesgo de tener una proteína anormal, como consecuencia estos mutantes de p53
promocionan el crecimiento anormal de la célula, por el contrario el tipo nativo o
salvaje bloquea el crecimiento tumoral. Estas mutaciones son más frecuentes a nivel del
codón 72 en la mayoría de los tumores de la cerviz uterina, aunque son necesarios
mayores reportes que confirmen su participación en algunos de los eventos de la
carcinogénesis del cuello uterino en el cual los papilomavirus humano de alto riesgo
tienen un rol causal aceptado y corroborado experimentalmente. Se ha descrito una
particularidad conocida como polimorfismo alélico de p53 sobre el codón 72 como posible
factor predisponente para la carcinogénesis cervical aunque aún con resultados poco
consistentes y discutibles (3, 6). La proteína p53 que contiene arginina en la posición
72 es más sensible al cáncer cervical que aquel que tiene prolina en la misma posición
por lo tanto nuestra observación de p53 detectada por inmunohistoquímica en este grupo
estudiado de displasias debe ser posteriormente ampliada para demostrar la mutación con
repercusión clínica en el manejo del paciente en mayor riesgo de desarrollar una
neoplasia o demostrar que corresponde a una acumulación por errores en su degradación la
cual generalmente es rápida y debida a proteínas con las que forma complejos como las
proteínas HDM2 y p300.
Es conocido que en la patogénesis del carcinoma de células escamosas del cuello uterino
se reporta una correlación inversa entre infección por papilomavirus humano y mutación
del anti-oncogén p53. Con respecto a los adenocarcinomas una posible correlación es
mucho menos conocida, sin embargo han sugerido que los adenocarcinomas papilomavirus
negativo o p53 positivo pueden constituir un subgrupo biológicamente distinto con un
pobre pronóstico (8). Es aceptado que la oncoproteína E6 de los papilomavirus de alto
riesgo se liga a la proteína de tipo nativo p53 promocionando su degradación, e
inhibiendo la estaibilidad y activación de p53 lo cual debería ocurrir normalmente en
respuesta a la expresión del oncogén HPV-E7, es decir, evento que permite la pérdida de
la función normal del anti-oricogén y consecuentemente favorece la carcinogénesis
cervical, mientras que mutaciones somáticas o deleciones involucran regiones conservadas
de antioncogenes preferentemente en carcinomas de células escamosas de la cerviz uterina
sin papilomavirus, al respecto en este grupo de displasias se estudiará posteriormente el
ADN del PVH para demostrar esta relación.
Debido al tiempo de vida corta de la proteína p53 tipo nativo, los anticuerpos empleados
en inmunohistoquímica para p53 no pueden discriminar entre p53 mutante o p53 nativo por
lo tanto toda proteína p53 detectable inmunohistoquímicamente es considerada mutante lo
cual hemos observado claramente en nuestro grupo de 15 displasias inmunoreactivas. Sin
embargo es necesario tener en cuenta que un incremento de la p53 tipo salvaje puede
ocurrir en respuesta al daño del ADN facilitando su detección por inmunohistoquímica.
Si bien es cierto nuestros resultados observados nos reflejan la presencia de una p53
mutada, en los casos de displasias con ausencia de inmunorcacción hemos considerado
necesario discutir la probabilidad de coloración falso negativo, la cual podría
significar en algunos casos un gen p53 mutado con inmunoreacción negativa, esto lo
podríamos explicar como una delección gruesa que permite la ausencia de producción de
la proteína p53 o por una mutación puntual que no pueda estabilizar suficientemente a la
proteína y sea necesario un mecanismo adicional así como un estado transformado avanzado
o de agresividad del tumor, eventos requeridos para una coloración p53 positiva. Algo
similar podría ocurrir en la interpretación del falso positivo, inmunoreacción que
puede confundirse como una consecuencia de la interrupción de los eventos de degradación
de la p53 como ha sido reportado por otros investigadores para este resultado(10).
Esta especulación sobre el falso negativo o falso positivo nos obliga también a
continuar estudiando posteriormente este grupo de displasias para determinar
molecularmente la presencia o no de alguna mutación en los casos positivos o negativos.
Por supuesto sin dejar de considerar en los resultados la manipulación del material
biológico y el tiempo y tipo de fijador a los cuales fueron sometidas las biopsias y que
definitivamente podrían repercutir en la interpretación final. Hemos observado una
relativa mayor frecuencia de la proteína p53 en displasia leve con respecto a la
displasia moderada y pese al tamaño de la muestra con respecto a la displasia severa, lo
cual nos permite especular sobre la presencia de cambios en el gen p53 en estadíos
iniciales en el proceso de alteración del epitelio cervical. En resumen concluimos que la
detección inmunohistoquímica de la sobre-expresión de la proteína p53 en este grupo de
displasias nos sugiere que podría estar relacionado con los eventos tempranos en el
proceso de carcinogénesis de la cerviz uterina y por consiguiente podría estar
indicándonos la naturaleza maligna de la lesión en un estadío temprano. Por lo tanto es
necesario estudiar un grupo mayor de displasias, empleando estrategias moleculares
diseñadas para identificar mutaciones específicas en determinados exones del gen p53
aplicando herramientas de diagnóstico tan sensibles como la reacción en cadena de la
polimerasa y análisis de secuencia para definir las mutaciones y el valor de p53 como
marcador que pueda ser considerado indicador pronóstico.
Agradecimiento- Los autores agradecen a la señora, Tec. Med. Estela
Aliano por su contribución en la realización de la inmunohistoquímica.
Bibliografía
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* Unidad de Biología
Molecular-Centro de Investigación en Cáncer Maes-Heller, Instituto de Enfermedades
Neoplásicas "Dr. Eduardo Cáceres Graziani".
** Departamento de Patología, Hospital Regional de Apoyo de Ica.
Correspondencia: Dra. Ivonne Guerrero, Jefe de la Unidad de Biología Molecular
Centro de Investigación en Cáncer Maes-Heller. Av. Angamos Este 2520 Lima 34-Perú
e-mail: iguerrero@inen.sld.pe
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