ONCOPROTEÍNAS VIRALES, APOPTOSIS Y PROLIFERACIÓN CELULAR EN LA
CARCINOGÉNESIS DE PULMÓN: E6-E7, P53,
BCL-2, BAX y PCNA

*Guerrero Ivonne, **Rodríguez Wuilbert,
°Amorín Edgar, *Mejía Roberto, °°Chang Alfonso.

. RESUMEN
. INTRODUCCIÓN
. MATERIAL Y MÉTODOS
. RESULTADOS
. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

El cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte en el mundo. Esta enfermedad ha sido dividida morfológicamente en dos tipos: el cáncer de pulmón de células pequeñas, extremadamente agresivo pero inicialmente sensible tanto a la quimioterapia como a la radioterapia; y el cáncer de pulmón de células no pequeñas el cual comprende mas del 75% de los tumores de pulmón, y es generalmente resistente a la quimioterapia. Aunque la quimioterapia es frecuentemente aplicada en el tratamiento de ambos, la diferencia en la quimio-sensibilidad observada en estos tipos de cáncer todavía es desconocida (12), y posiblemente se encuentren involucrados genes específicos. La neoplasia de pulmón como cualquier otro proceso de múltiples eventos involucra un número de aberrantes eventos genéticos que culminan en transformación maligna, siendo la acción de los oncogenes involucrados en la iniciación y progresión de la neoplasia y los genes supresores de tumores los cuales producen tumores siguiendo su inactivación o pérdida de su expresión, identificados durante el curso de la enfermedad (14). La apoptosis puede iniciarse cuando ocurre daño en el ADN causando la pausa de la célula en su ciclo reproductivo, si el ADN es reparado, la célula procede a la muerte celular apoptótica. Cuando el o los mecanismos involucrados en el camino de la apoptósis se altera, la célula no muere. El cáncer de pulmón desarrollado está fuertemente relacionado a agentes ambientales como el humo del cigarro a quien se le atribuye ser el responsable de la mayoría de los casos por los carcinógenos que contiene, como el benzo(a)pireno. Durante la década pasada un número de oncogenes y genes supresores de tumores ha sido identificado en diferentes eventos del proceso carcinogenético. El gen p53 localizado en el eromosoma 17 codifica para una fosfoproteína nuclear de 53 KDa cuya función como factor de trascripción está implicada en la regulación del ciclo celular y subsecuentemente en el control de crecimiento. Grandes niveles de actividad apoptótica asociada significativamente con proliferación celular e independencia de la expresión de p53 y bcl-2 ha sido observada en el carcinoma de células no pequeñas del pulmón por Tormanen (26).La mutación en el gen p53 con implicancias clínicas es una de las anormalidades más comunes encontradas en todos los tipos de cáncer (9) y ha sido reportada por Takaltashi en más del 50% de los cánceres de pulmón (24).Una interesante asociación entre bcl-2 y p53 con el factor de crecimiento endotelial vascular ha sido demostrada por Fontanini, quien aduce la posible acción de estas proteínas en el control del desarrollo de la angiogénesis del tumor en el carcinoma de células no pequeñas del pulmón, además del posible rol que cumplen en la progresión y muerte celular(4,3).

Bcl-2 es un oncogén localizado en 18q2l, con función antiapoptótica, sin embargo es convertida a un efector de muerte parecido a Bax por caspasas, sugiriendo que la expresión de Bcl-2 puede no favorecer el crecimiento de cánceres, habiéndose demostrado en gliomas que Bcl-2 tiene dos funciones importantes una antiapoptótica y otra proapoptótica dependiendo del nivel de su expresión (21). La proteína Bax actúa como un regulador de apoptosis para formar heterodímeros con la proteína bcl-2, en consecuencia promociona la sobrevida de la célula.

El antígeno de proliferación celular (PCNA) es una proteína no histona de 36 Kd de peso molecular, localizada en el núcleo de las células, juega un rol en la iniciación de la proliferación celular mediante la ADN polimerasa. Los niveles de PCNA se encuentran elevados en las fases S, G2, y M de la mitosis celular en tejidos normales y malignos.

Algunos papilomavirus humanos oncogénicos en el cuello uterino están también asociados con proliferaciones benignas y malignas en otros órganos entre los que se incluyen los pulmones. Actualmente, la asociación de PVH con los tumores del tracto respiratorio bajo no está claramente definido porque aún los estudios son difíciles de definir y comparar, sin embargo se conocen datos significativos como los que Da reportó cuando detectó ADN-PVH empleando PCR en el 55% de su serie de cáncer de pulmón (1), mientras que en Okinawa detectaron el 79% con PCR y el 53% empleando hibridación in situ(HIS) y en Niigata el 30% con PCR y el 20% con HIS(10). En relación a los tipos virales Thomas reportó una frecuencia simultánea del 11% para los PVH-6, 11, 16 y 18 en el carcinoma de células escamosas de pulmón (25).

El objetivo de esta investigación fue evaluar el comportamiento de oncogenes y genes supresores de tumores y su asociación con las oncoproteínas de los papilomavirus humano en la carcinogénesis de la neoplasia de pulmón de dos pacientes con historia antigua de papilomatosis laríngea recurrente positivas al ADN-PVH.

Se estudiaron las biopsias de pulmón de tejido incluido en parafina, de dos pacientes con diagnóstico de carcinoma epidermoide de células no pequeñas, con antecedente de papilomatosis laríngea recurrente, atendidas en el Instituto de Enfermedades Neoplásicas "Dr. Eduardo Cáceres Graziani".

*Inmuno-histoquímica.-

De las muestras quirúrgicas parafinadas se tomaron cortes de 5 micras de espesor y se depositaron en porta-láminas previamente tratadas con fijador, luego fueron sometidas al complejo inmunohistoquímico Avidina-Biotina, empleando un panel de tres anticuerpos monoclonales Zymed para bcl-2 la clona BCL-2-100, bax clona 2D2 y para PCNA la clona PC10. Para p53 se empleó el complejo peroxidasa anti peroxidasa con la clona DO-7 de Dako. La diaminobenzidina fue utilizada como cromógeno revelador de la inmunoreacción en ambos sistemas de marcaje. Los casos fueron registrados con un porcentaje de células positivas por campo teniendo como referencia un control positivo conocido para cada anticuerpo empleado.

*Extracción de ADN-

El material biológico para la detección del genotipo de los PVH fue micro disecado y sometido a digestión enzimática con una proteasa y un detergente, el ADN fue purificado con fenol, cloroformo, alcohol isoamílico y precipitado con etanol. El ADN fue resuspendido en TE y cuantificado por el método espectrofotométrico.

*Reacción en cadena de la polimerasa, La mezcla de reacción para la amplificación enzimática se preparó en un volumen de 50 ul de solución con las siguientes condiciones: buffer PCR 1X , 100 pmol de cada cebador tipo específico (7 tipos virales) , 400 mM dntp , 3mM MgCL2, 2.5U amplitaq ADN pol, y 5 ul de ADN.

La mezcla fue sometida a 40 ciclos de amplificación constituidos por: 95°C durante 1 minuto, 55°C por 2 minutos y 72°C por 1 minuto. Los productos de amplificación fueron corridos sobre geles de agarosa al 4%, teniendo como patrón un marcador de peso molecular conocido, visualizado con bromuro de etidio. Se emplearon en el estudio controles virales positivos y negativos conocidos. Las tallas de los productos amplificados para los PVH fueron de 230, 89, 134, 119, 97, 132, y 186 pares de bases respectivamente para cada uno de los siete genotipos virales estudiados.

*Análisis de restricción.-

Los productos de amplificación del control y de los casos en los cuales se observó una banda en el corrido electroforético fueron sometidos a clivaje de restricción, y el correspondiente análisis de los subproductos en geles de agarosa.

Hemos estudiado las biopsias de pulmón de dos pacientes mujeres con diagnóstico de carcinoma epidermoide de células no pequeñas, de 32 y 35 años de edad y naturales de Arequipa y Lima respectivamente. Ambas reportaron historia de papilomatosis laringotraqueal recurrente, desde la niñez una de ellas y la otra desde la juventud. La primera, (TP42), fumadora crónica desde los 15 años (5-10 cigarrillos diarios aprox.), y ocasionalmente consumidora de alcohol; la segunda paciente (TPP 185) negó estos hábitos (tabla l). El análisis molecular del ADN de los papilomavirus humano estudiados empleando la PCR, fue positivo para ambos casos. La tipificación viral correspondió a infección múltiple por PVH de bajo y alto grado de potencial oncogénico, en el caso TPP 185 se observaron los tipos de PVH- 11, 16, 18 y 31 y en el caso TP42 los tipos 6, 11, 16 y 18 (tabla 2) (Fig. l). En cada caso el control del ADN para el gen de la beta globina humana fue positivo y requisito indispensable previo para el análisis molecular. La inmunomarcación en TP42 fue negativa para p53 y bcl-2 y positiva para PCNA y bax, en TPP185 la inmunoreacción fue positiva para p53, bcl-2, bax y fuertemente positiva en la casi totalidad de las células tumorales para PCNA (tabla 2).

FIG. N° 1 Se observa el corrido electroforético post PCR de la paciente TP 24 mostrando infección múltiple a cuatro tipos de PVH en la biopsia de carcinoma de pulmón: M - marcador de peso molecular, a - PVH-6, b- PVH-11, c - PVH - 16, d - PVH - 18

Se observa el corrido electroforético post PCR de la paciente TP42 mostrando infección múltiple a cuatro tipos de PVH en la biopsia de carcinoma de pulmón: M -marcador de peso molecular, a - PVH-6, b - PVH- 11, c - PVH- 16, d - PVH- 18.

Continuamente se incrementan las evidencias del rol de los virus en la patogénesis de ciertos cánceres humanos, un número de estos virus, entre los que se incluyen retrovirus, adenovirus, herpes simple y más recientemente el papilomavirus humano han sido considerados en la posibilidad de jugar un rol importante en el cáncer de las vías respiratorias y cavidad oral (10). Sugiriendo McKaig a la cavidad oral como puerta de entrada y reservorio de los PVH (15) ya sea vía transmisión sexual por contacto genital-oral, transmisión perinatal o auto-infección de contacto genital por las manos.

Hay evidencia que indica que ciertos virus tumorales ADN ejercen efectos oncogénicos sobre sus células huésped por interacción con proteínas celulares. En el caso de los papilomavirus humano, el PVH-16 potente agente transformante in vitro y detectado en ambas pacientes de nuestro estudio, produce las proteínas transformantes E6 y E7 las cuales forman complejos con los productos de los genes supresores de tumores p53 y pRb respectivamente. Las proteínas E6 codificadas por los PVH 16 y 18 promocionan la degradación de la proteína p53 inactivándola (2,23), evento que caracteriza a una de nuestras pacientes, TPP 185, la cual negó el consumo de tabaco, y observó una marcada sobre-expresión de la p53 en el núcleo de las células tumorales; por el contrario la otra paciente, TP42, fumadora crónica no evidenció mutación con inmunoreacción a p53 por el método de inmunomarcación empleado a diferencia de los estudios relacionados al gen p53 en cáncer de cabeza y cuello que han demostrado su sobre-expresión en relación con la historia de fumador crónico (2), sin embargo nosotros podemos asumir en estos dos casos el probable rol oncogénico de los PVH de alto riesgo detectados en el tumor de pulmón y reportados también tempranamente en las papilomatosis laríngeas que las precedieron al debut del cáncer al pulmón, notándose que el tabaco no necesariamente tuvo un rol principal en estos eventos. Es importante mencionar que la transmisión perinatal de PVH a neonatos durante el parto ha sido demostrada en varios estudios en mujeres que no presentaron clínicamente lesiones aparentes, relacionadas a PVH (5, 22, 20) y en aspirados nasofaríngeos de recién nacidos con madres positivas se ha detectado ADN del PVH en un rango que oscila entre 1.0% - 47.8% de las muestras(18), en algunos de estos neonatos no se ha encontrado concordancia entre los tipos detectados en la madre antes y después del parto con los tipos detectados en las muestras de la orofaringe del neonato, esto nos sugiere también múltiples caminos de transmisión para los PVH. Así mismo asumimos que la vía de transmisión de PVH en la paciente TP42 pudo haber sido vertical de madre a hijo por la temprana presencia de papilomatosis viral a los seis meses de nacida la cual persistió durante la infancia y juventud, periodo en el cual se le adicionó otro factor de alto riesgo como el consumo de tabaco, posteriormente la infección viral se extendió hasta albergarse en el tejido broncopulmonar donde asumimos contribuyó en el proceso de carcinogénesis de la neoplasia pulmonar. Kellokoski reportó que más del 50% de las mujeres que practican sexo oral albergan algún tipo de PVH en la mucosa oral y vías respiratorias (13), esta vía de transmisión de PVH correspondería a la paciente TPP185 cuyo hábito sexual correlaciona inicialmente con la presencia de papilomas laríngeos persistentes y posterior neoplasia de pulmón, comportamiento que pudo haberle transmitido la carga viral. En ambas pacientes coincidieron los tipos virales de alto riesgo en sus muestras de laringe y pulmón simultáneamente, sin embargo no se puede descartar alguna otra vía de transmisión aún no conocida de las ya mencionadas en estos casos. Resulta interesante hacer hincapié en la presencia del ADN del papilomavirus humano tipo 11, considerado experimentalmente hasta ahora de bajo potencial oncogénico, detectado en los papilomas respiratorios recurrentes y en la neoplasia del pulmón en ambas pacientes estudiadas como lo reportaron también otros investigadores ( 6,19). Nuestra observación en la paciente, TPP185, es análoga a otros reportes (6) de papilomatosis laríngea recurrente y neoplasia maligna de pulmón no relacionada a irradiación o tabaco, los cuales ocurren frecuentemente en pacientes previa terapia de radiación o historias de fumadores crónicos; además de la observación de la p53 mutada lo cual se asociaría en esta paciente a la integración del PVH- 11 al genoma de la célula broncopulmonar, promocionando una inestabilidad genética progresiva la cual probablemente permitió el desarrollo y expansión clonal de la lesión maligna de pulmón a partir de la papilomatosis laríngea recurrente previa. Esta integración del ADN del papilomavirus humano tipo 11 al genoma de la célula nos inquieta a continuar investigando para demostrar molecularmente esta integración y la inestabilidad genómica resultante que podría ser responsable de la mutación del gen supresor de tumor p53 con consecuencias en el desarrollo de la neoplasia de pulmón.

La positividad de la p53 mutada predice un pronóstico pobre y tiempo de sobrevida corta dato que coincide con Tormanen en su grupo de carcinomas de pulmón de células no pequeñas (27, 11). Es necesario considerar también que la expresión de p53 y PCNA simultáneamente en esta paciente TPP185 constituyen algunos de los marcadores que están estrechamente relacionados con el potencial metastásico del tumor (16) lo cual podría contribuir en la práctica clínica así como en el pronóstico de la paciente.

Si bien es cierto la proteína Bcl-2 es conocida como antiapoptótica y dicha expresión puede ser aplicada como predictor de quimiosensibilidad para cáncer de pulmón, es necesario considerar, ahora, que los excesivos niveles de expresión de la proteína inducen apoptósis en asociación con las caspasas - 1, -3 y 8 como fue demostrado en las células U251, es decir la sobre-expresión de bcl-2 activa la cascada proapoptótica; por el contrario bajos niveles de expresión de bcl-2, como hemos observado en uno de los casos estudiados, inhibe verdaderamente la función proapoptótica de fas como reportó Shinoura en estudios realizados en células U251(2l). También se postula que bcl-2 forma canales para el transporte de iones o proteínas en la membrana mitocondrial, y que bcl-2 y bax pueden formar canales citotóxicos en las células, con heterodimerización de bcl-2/bax anulando la actividad del canal y promocionando de esta forma la sobrevida de la célula y resistencia a la apoptosis, evento que caracteriza al caso TPP185.

La detección de bax en los casos de cáncer de pulmón es un elemento esencial en las señales moleculares que resultan en la muerte celular o apoptosis. (7,8), y esto es aplicable al fenómeno apoptótico post la terapia de radiación observado en nuestra paciente TP42 en la cual la expresión de la proteína bax está asociada con la apoptosis inducida por la terapia de radiación a la que fue sometida. Es necesario estudiar este marcador en una casuística mayor para determinar si en cáncer de pulmón la sobre-expresión de bax después de la radiación se relaciona con buena sobrevida como ha sido reportado para cáncer cervical (17).

La proliferación celular descontrolada es la característica de los tumores malignos como se ha determinado en nuestro estudio al ser detectado en el núcleo de las células tumorales el indicativo de un elevado índice mitótico, al antígeno de proliferación celular, por lo tanto el potencial proliferativo de las células tumorales es un importante factor pronóstico. Sin embargo la evaluación del significado pronóstico de la expresión de las proteínas involucradas en la regulación de la proliferación celular debe ser estudiada en un grupo mayor de casos. Nosotros detectamos en nuestro estudio la proteína PCNA en ambos casos, observándose una diferencia significativa de mayor concentración de proteína en casi la totalidad de las células tumorales en el caso TPP185 indicativo de gran actividad mitótica versus un aproximado del 55% de las células tumorales en TP42, lo cual nos permite confirmar, pese a la diferencia en la expresión de esta proteína PCNA, como marcador de proliferación celular en estos tumores estudiados.

Podemos concluir que en nuestro estudio de dos casos como en algunos carcinomas de otras localizaciones entre los que se incluye los de pulmón, la inactivación del producto del gen supresor de tumor p53, ya sea por mutación o indirectamente por el papilomavirus humano, las dos rutas alternativas sugeridas de transformación maligna, la p53 jugó una parte importante en el desarrollo del carcinoma de pulmón, como en el caso TPP185, los PVH de alto riesgo contribuyeron con este evento, ligándose e inactivando a la proteína p53.

El hallazgo de oncogenes y genes supresores de tumores en el cáncer de pulmón permite ampliar el entendimiento de los procesos de esta enfermedad considerando la morfología, la clínica y la exposición a los carcinógenos. El potencial clínico de estos marcadores moleculares debe ser aplicado cuidadosamente en los campos de diagnóstico y pronóstico y puede en el futuro tener un efecto favorable en la terapia. Nuestro estudio sugiere también un posible rol de los PVH en el desarrollo de la neoplasia de pulmón en pacientes con historia previa de papilomatosis laríngea crónica recurrente con análisis molecular positivo para PVH como vía de diseminación hacia los pulmones, constituyéndose en reservorios de esta carga viral, por lo que se hace necesario estudiar una casuística mayor que permita establecer su rol en el desarrollo de la neoplasia de pulmón y definir su interrelación con los genes celulares.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Sra. Estela Aliano, Tec.Med. por la realización cuidadosa de las pruebas inmunohistoquímicas, y a la compañía Gery Representaciones E.I.R.L. por su valiosa contribución de productos Zymed para la culminación de este estudio.

Bibliografía

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* Unidad de Biología Molecular del Centro de Investigación en Cáncer Maes-Heller,
** Departamento de Medicina, °Departamento de Tórax, °°Departamento de Patología. Instituto de Enfermedades Neoplásicas Dr.Eduardo Cáceres Graziani. Av.Angamos Este 2520, Lima 34 - Perú.
Correspondencia: Dra. Ivonne Guerrero-Alva, Jefe de la Unidad de Biología Molecular.
e-mail: iguerrero@inen.sld.pe .telefax: 511-4483162

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