REORDENAMIENTO DE GENES BCR-ABL EN EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
DE LA TRANSLOCACIÓN t(9;22) EN LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA.
APLICACIÓN DE LA NESTED RT-PCR.

Dra. Ivonne Guerrero Alva*

INTRODUCCIÓN


Consistentes anormalidades citogenéticas han sido reportadas para muchos desórdenes mieloides crónicos y agudos puntualizando en los loci cromosomales que contienen los genes humanos los cuales pueden estar involucrados en la patogénesis de esas enfermedades. Clonando y secuenciando esos puntos de quiebre indudablemente se ha permitido el conocimiento de muchos genes los cuales juegan un rol crítico en el control de diferenciación y proliferación en células mieloides. La ruptura de estos genes por translocación cromosomal, mutación o delección presumiblemente alterarían su estructura o expresión permitiendo el proceso de tumorigénesis. La utilización de sondas y cebadores derivados de ellos ha facilitado y mejorado el diagnóstico y clasificación de las enfermedades mieloides.

La caracterización genómica de la leucemia ha permitido identificar los genes involucrados en los puntos de quiebre en desórdenes mieloides, revelando las bases moleculares de estas malignidades mieloides. Una translocación cromosomal consistentemente recurrente en malignidades de la línea mieloide ha sido bien caracterizada a escala molecular: esta es la translocación del cromosoma (Ph) philadelphia t(9;22)(q34;q11), dando lugar a un gen quimérico que codifica una proteína de fusión con habilidad transformante (7). La aplicación de sondas moleculares y cebadores derivados de los genes involucrados en la translocación Ph han definido las bases biológica y molecular de las leucemias crónica y aguda con esta translocación y han refinado el diagnóstico de estos desórdenes.

Se ha determinado a nivel molecular dos genes como consecuencia de la translocación Ph: el proto-oncogen Abelson (c-abl) en el cromosoma 9 banda q34 y el gen Bcr mapeado en el cromosoma 22q11. El cromosoma Ph es encontrado en el 95% de los pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC) y aproximadamente entre el 1-2% de adultos con leucemia mieloide aguda (LMA) (8). El cromosoma Ph es también la anormalidad cromosomal que se presenta con cierta frecuencia en leucemia linfoblástica aguda en la cual alrededor del 5% de niños y el 20% o más de adultos son positivos.

Estructura de los genes Bcr y Abl en la translocación Phi de la LMC:

El proto-oncogen Abelson (c-abl) fue mapeado molecularmente sobre el cromosoma 9 banda q34 en el año 1983 (3) y se demostró inmediatamente que está involucrado en la translocación del cromosoma Ph en LMC (3,6). Así mismo se demostró que este proto?oncogen c-abl se fusiona a otro gen sobre el cromosoma 22 banda q11, referido como el gen bcr (nombre derivado de las iniciales del inglés breakpoint cluster region) cuya función en las células normales no está aun bien definida. Estudios posteriores determinaron que el locus ber es muy complejo, y que son varios los genes bcr relacionados en el cromosoma 22q11 (4).

El gen c-abl se expande sobre 230 kilobases (kb) y contiene 11 exones (10), y experimenta splicing alternativos para generar por lo menos dos transcriptos ARNm de 6.0 y 7.0 kb en células normales. El gen Bcr se extiende al menos sobre 100 kb y la región del conglomerado de puntos de quiebre de 5.8 kb en LMC se ubica en la mitad de este gen. Aunque la función del gen Ber normal es desconocida, éste codifica al menos 2 transcriptos de 4.5 y 6.7 kb, y se le ha identificado una proteína de 160 kd. Al contrario de c-abl, el cual es expresado predominantemente en células hematopoyéticas, el producto del gen Bcr es expresado en niveles constitutivos en muchas líneas (10).

   LMC Ph+: el cien por ciento de los pacientes con LMC que tienen cromosoma Ph demostrado por estudio citogenético, tienen la fusión molecular de los genes Bcr y c-abl, la cual puede ser detectada por análisis molecular como Southern Blot, PCR o RT-PCR.

   LMC Ph-: un pequeño porcentaje de pacientes con características morfológicas y clínicas de LMC son Ph negativo. A pesar de los estudios citogenéticos negativos han demostrado tener la fusión de los genes Bcr y c-abl, es decir esos pacientes tienen la LMC clásica definida por tecnologías moleculares aun cuando el Ph no pudo ser detectado en los límites de resolución de la citogenética como ha sido demostrado por muchos investigadores (10). Algunos de esos pacientes tienen la translocación Ph compleja o variante que enmascara al Ph clásico. Han presentado cambios intersticiales en una pequeña cantidad de material genético entre los cromosomas 9 y 22, favoreciéndose la fusión de secuencias de Bcr y Abl que permiten una translocación no evidente a nivel citogenético siendo necesario el empleo de métodos moleculares para su detección. De los métodos moleculares conocidos, la reacción en cadena de la polimerasa PCR es considerada como una prueba rápida y de gran poder para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. Ha sido usada para amplificar transcriptos Bcr-Abl después de la transcripción reversa del ARNm por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) mayormente empleando un set común de cebadores. El control de la contaminación y la sensibilidad de esta prueba se ha visto incrementada por el empleo del primer producto de amplificación de la PCR para un segundo round de amplificación empleando sets de cebadores internos (nested) al primer segmento, N-RT-PCR, suficiente para detectar una célula Bcr-Abl positiva en 10 a las siete células negativas a esta translocación.

El objetivo del estudio fue investigar molecularmente, a nivel del ARN, el híbrido Bcr-Abl del transcripto quimérico identificando el reordenamiento del conglomerado de los puntos de quiebre responsable del producto quimérico de fusión: la proteína p210 ó p190 de la translocación t(9;22) en diez casos de leucemia mieloide crónica.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se ha investigado a nivel molecular el reordenamiento de los genes Bcr/Abl en seis muestras de sangre periférica y cuatro de médula ósea provenientes de diez pacientes con leucemia mieloide crónica respectivamente.

Ambos tipos de muestra, SP y MO, fueron recepcionadas en condiciones adecuadas de esterilidad y correcta manipulación de las poblaciones celulares para el estudio molecular.

   Extracción de ARN.- las células de SP y MO fueron lisadas con tiocianato de guanidio, tratadas con fenol y solventes orgánicos; el ARN fue precipitado con acetato de sodio 2M y etanol a temperatura bajo 0°C. Posteriormente secado y resuspendido para su cuantificación espectrofotométrica y corroboración electroforética. El ARN debe ser cuidadosamente manipulado para prevenir su degradación.

   Síntesis de cADN.- se preparó una mezcla de reacción con 0.5 ugr/ul de ARN, 1 ul de hexámeros, buffer 5x, 10 mM de DNTP, 0.1 M de DTT y 40U de RNAsa, posteriormente se le adicionó 1 ul de transcriptasa reversa a temperatura ambiente y se llevó a ciclar a 40°C durante 60 minutos, 99°C Y y 4°C 5'; finalmente se llevó a -80°C.

   Reacción en cadena de la polimerasa.- se preparó una mezcla de reacción constituida por buffer 5x, dntp 10mM, MgC12 25mM, sentido/antisentido (b3a2, b2a2, b1a3) 10pm/ul, taq polimerasa IU y agua 0destilada; esta mezcla fue sometida a 35 ciclos de amplificación constituidos por 94°C 30", 65°C 30", 72°C 30", condiciones aplicadas también para la nested o segundo round de amplificación.

   Electroforesis en geles de agarosa.- los productos de amplificación fueron sometidos a análisis después del corrido electroforético visualizado con bromuro de etidio y la ayuda de luz ultravioleta teniendo como parámetro un marcador de peso molecular.

   Controles.- en cada caso analizado se procedieron controles positivo, negativo y blanco conocidos, lo cual determinó la veracidad y pulcritud del estudio.

RESULTADOS.-

Los diez casos estudiados de LMC, mostraron un patrón de reordenamiento de genes quiméricos, observándose en 9 de ellos la forma b3a2 y en uno la forma b2a2 responsables de la proteína de fusión o quimérica p210 (Cuadro 1).

Cada uno de los productos de la primera amplificación de los casos investigados en los cuales se identificó la translocación fueron sometidos a una nested de amplificación N-RT-PCR empleando una secuencia interna específica a los exones en estudio en la cual se confirmó el reordenamiento b3a2 o b2a2. El análisis molecular se realizó sobre la base de la medida de los productos de amplificación establecidos previamente, para lo cual se tomó como referencia un marcador de peso molecular, correspondiendo 417pb para b3a2, (Fig. 1) y 342pb para b2a2 en la primera amplificación; y en la nested 360pb y 285pb respectivamente. En ninguno de ellos se observó el producto de amplificación de 381 pb del reordenamiento quimérico para la forma e1a3 correspondiente a la p190 que caracteriza a la LLA. Todos los casos mostraron un producto de amplificación de 277 pb correspondiente a un segmento del gen Abelson normal "Abl-n" (Fig 2).

Figura 1. Amplificación del cADN de SP del paciente SP1 analizado por N-RT-PCR. Línea Abl-n: amplificación del gen normal Abelson, línea M: marcador de peso molecular, línea b3a2: amplificación del transcrito Bcr-Abl mostrando la unión b3a2 del tipo p210, líneas c+: controles positivos de Abl-n y b3a2 conocidos, líneas c-: controles negativos respectivos.

Figura 2. Gel de agarosa mostrando el producto de amplificación del gen Abelson-normal Abl-n de 277 pb correspondiente a las muestras de SP de 2 pacientes y a la Mo de 2 pacientes. Control positivo conocido C+, control negativo conocido C- y marcador de peso molecular M.

DISCUSIÓN.-
En esta investigación se ha identificado el gen quimérico Bcr-Abl a partir del ARN extraído de sangre periférica y médula ósea de pacientes con leucemia mieloide crónica, mediante la N-RT-PCR, procedimiento molecular cuya sensibilidad es suficiente para detectar una célula Ber?Abl positiva en 10 a las siete células negativas a Bcr-Abl (1). El producto del gen quimérico Bcr-Abl después de transcrito a ARN quimérico sufre una serie de reordenamientos a nivel de intrones y exones, los cuales posteriormente son traducidos a proteínas como la p210 que caracteriza a la leucemia mieloide crónica y es capaz de inducir expansión de células pre-B de médula ósea in vitro o inducir LMC en ratones in vivo. Por el contrario la p190 que caracteriza preferentemente a la leucemia linfática aguda tiene el cromosoma Ph citogenéticamente idéntico al de la LMC, pero a nivel molecular las diferencias permiten un diagnóstico más preciso entre el Ph+ de LLA y el Ph+ de LMC. Es necesario tomar una decisión para elegir correctamente el probable splicing alternativo que sufre el ARN después de ser transcrito considerando los ya descritos para LMC por otros investigadores para las formas e6a2, a3a2, e1a2, b2a3, b3a3, b3a2, b2a2 etc., estas dos últimas estudiadas por Hocchaus en 1996, aquellas que involucran los exones bcr2, bcr3 y abl2 para el punto mayor de ruptura, investigados en este grupo de diez casos, o la forma e1a3, exones bcr1 y abl3 para el punto menor de ruptura que caracteriza a LLA, estudiados también en este grupo para confirmar su no reordenamiento. Estudiar el reordenamiento genético a escala molecular espontáneo o provocado por cofactores extra o intracelulares implica tener un conocimiento de los mapas de los genes de interés, como en este caso lo son para la leucemia mieloide crónica Bcr y Abl. Los mapas de los genes Bcr desde el centrómero a la porción distal del brazo largo (q) del cromosoma 22 mantienen el siguiente orden: BCR2 -> BCR4 -> gen de la cadena ligera 1 de las inmunoolobinas -> BCR1 -> BCR3 SIS (proto-oncogen PDGF-B), genes a partir de los cuales se diseñaron los cebadores utilizados. Por otro lado el proto-oricogen c-abl largamente conservado en la evolución, codifica una proteína tirosina-quinasa, enzima que fosforila residuos de tirosina sobre proteínas celulares. La tiros¡na-quinasa Bcr-abl está asociada con la cara citoplásmica de la membrana plasmática en la célula maligna donde puede funcionar como una señal de transducción. Sin embargo la proteína c-abl normal está localizada en el núcleo (14) y su rol funcional total es aún desconocido. El producto del gen Bcr-Abl, después de transcrito sufre una serie de reordenamientos a nivel de intrones y exones, evento que recibe el nombre de splicing alternativo eliminando intrones y reordenando exones, lo cual nos permitimos identificar en este estudio extrayendo el ARN. Estos rearreglos posteriormente son traducidos a proteína, lo cual inferimos en estos diez casos estudiados en los que el reordenamiento identificado b3a2 y b2a2 es responsable de la proteína 210 comúnmente llamada p210 que caracteriza a la LMC y cuya frecuencia descrita para estas formas por otros investigadores corresponde al 75 y 25% respectivamente. Para comprender mejor las formas de fusión identificadas mencionemos que uno de los splicing se presenta con frecuencia en el gen Abl entre los dos exones Ib sobre el primer set de exones comunes II, alternativamente los dos exones Ia pueden también ser unidos sobre los exones comunes II, generando un transcrito ARNm con un 5' final diferente, como observamos en la Figura A.

Cada ARNm tiene una secuencia 3' común que codifica el dominio tirosina quinasa catalítico c-abl, si estos diferentes transcritos codifican proteínas con diferentes funciones es la pregunta que está siendo estudiada. Sólo una proteína de c-abl de 145 Kd ha sido identificada en células normales. Los sitios de rearreglos dentro del gen c-abl en diferentes pacientes con LMC son muy heterogéneos y pueden ocurrir en alguna parte de las 100 kb del filamento superior del exón común II de c-abl como ha sido reportado por Kurzrock (10). Por el contrario, el rearreglo dentro del gen bcr sobre el cromosoma 22 en diferentes pacientes con LMC puede ocurrir dentro de una muy pequeña región de 5.8 kb en el gen Bcr, atribuidos a la región del conglomerado de puntos de quiebre de la LMC como se observa a continuación en la Figura B.

En la translocación Ph de la LMC, los genes c-abl y Bcr se fusionan de tal manera que uno de los cinco pequeños exones en la región bcr de 5.8 kb de la LMC se fusiona al exón común II en c-abl, creando un nuevo gen sobre el cromosoma Ph, el cual es una fusión entre secuencias 5'Bcr y secuencias c?abl 3' identificada en esta investigación y esquematizada en la Figura C.

Esta fusión de genes codifica un ARNm de 8.5 kb, cuyas secuencias 5'Bcr empalman directamente sobre el exón II común c-abl, que codifica una proteína de fusión de 210 kd con secuencias Bcr sobre el amino terminal y el dominio catalítico tirosina quinasa de c-abl sobre el carboxilo terminal. Esta proteína de fusión de 210 kd con sus secuencias Bcr amino terminal tiene una actividad tirosina quinasa enormemente elevada comparada a la proteína de 140 kd codificada por las células c-abl normales. Presumiblemente, esta elevada actividad tirosina quinasa es la responsable del incremento del pool de células progenitoras mieloides a perpetuidad que continuarán a diferenciarse en la fase crónica de la LMC, resultando en una cantidad elevada de células mieloides circulantes maduras, proteína que definitivamente caracteriza al grupo estudiado, hecho que se infiere de los transcritos quiméricos b3a2 y b2a2 identificados. Es importante resaltar que la LMC en niños y adultos tiene esencialmente la misma localización del punto de quiebre en Bcr, patrón que difiere en el caso de la leucemia linfoide aguda Ph positivo como fue reportado por Fioretos (5).

Recordemos estudios iniciales, quienes sugirieron que la precisa localización del punto de quiebre dentro del conglomerado de puntos de quiebre de la LMC podría estar asociado con diferencias en el pronóstico de los pacientes con LMC. Si estos puntos de quiebre ocurren entre exones 2 y 3, entonces sólo los exones 1 y 2 en el conglomerado LMC bcr de 5.8 kb estarían involucrados en la fusión con c-abl, este tipo de punto de quiebre se le asoció con la fase estable de la LMC y una duración larga de la fase crónica. Por otro lado los puntos de quiebre después del exón 3 con una fusión de genes que contienen los exones 1, 2 y 3 del conglomerado LMC bcr de 5.8 kb presumiblemente codificarían dos proteínas con ARNm empalmados alternativamente, estas proteínas podrían variar sólo por una pequeña secuencia codificada por el exón 3 y estar asociadas con el alto riesgo para entrar en crisis blástica con una corta duración de la fase crónica o mantenerse en fase estable, este controversial hecho obliga a seguir estudiándolo considerando las variables clínicas, genéticas y moleculares para obtener su valor predictivo. Es conveniente mencionar que se está postulando actualmente como ocurre en los procesos de carcinogénesis de varios eventos la participación de otro gen celular en el desarrollo de la LMC, el proto-oricogen CRK, localizado en el cromosoma 17p13, segmento frecuentemente delecionado durante la fase de progresión en LMC, posiblemente involucrado en la progresión de la enfermedad, así como la metilación del promotor Pa Abl usualmente retenido en este oncogen quimérico y frecuentemente encontrado como marcador de eventos tempranos de la LMC en precursores hematopoyéticos (13). Parece ser también que algunos procesos de maduración y señalización de transmembrana están bloqueados así como los efectores de apoptósis.

La identificación de la translocación a nivel molecular resulta de mayor importancia por la contribución de Vickers quien postuló un modelo matemático el cual predice que se requieren tres mutaciones en el stem cell para causar LMC (15). Por otro lado la persistencia de las células que expresan ARNm-Bcr-Abl después de un transplante de médula ósea alogénico también ha sido descrito (2,9,11,12).

En conclusión el rearreglo de los genes Bcr y Abl, la detección del transcrito de fusión de 8.5 kb o la detección de la proteína de fusión de 210 kd constituyen el sello diagnóstico molecular de la LMC. La ausencia de estas características puede implicar que una enfermedad no sea LMC, pero imite un desorden mielodisplásico. Por lo que el análisis molecular de LMC empleando la herramienta RT-PCR es considerada ahora el diagnóstico estándar para esta neoplasia lo que nos permite sugerir su utilización en el estudio del reordenamiento b3a2 y b2a2 de la t(9;22) en casuísticas nacionales más grandes que la reportada que nos permitan correlacionar el hallazgo molecular con las características clinicas y pronóstico del paciente.

Nuestro estudio corrobora también el hallazgo reportado por otros investigadores moleculares en otras poblaciones sobre el rol del punto de quiebre M-Bcr-Abl, p210 en la determinación y mantenimiento de la leucemia mieloide crónica en este grupo de casos, puntualiza la eficiencia de la RT-PCR con su variante nested en su identificación molecular y la utilidad en aquellos casos en los cuales no puede ser detectada por la citogenética clásica siendo necesaria su aplicación para el diagnóstico y monitoreo de la respuesta a la terapia, estimando la leucemia mínima residual después de un tratamiento o de un transplante de médula ósea.


Ver Bibliografía

*Correspondencia: Dra. Ivonne Guerrero, Investigadora, Laboratorio de Investigación y Diagnóstico Molecular Oncológico MAMLAB, Calle Montegrande # 109 Of. 208, Surco, Lima 32-Perú.
E-mail: MAMLAB@terra.com.pe
Telf. 7224890.

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