HALLAZGOS CITOGÉNETICOS EN CÁNCER DE PRÓSTATA

 Dr. Carlos A. Tirado, M.S., Ph. D.
 

RESUMEN

Los estudios cilogenéticos han sido buenos instrumentos en la caracterización de múltiples tipos de cáncer especialmente en el monitoreo y diagnóstico de malignidades hernatológicas, sin embargo en el campo de los tumores sólidos, el campo de la citogenética no ha avanzado mucho, puesto que el cultivo de muchos tumores epiteliales continúa siendo bastante difícil y laborioso (Brothman, /999).

El cáncer de próstata se ha convertido en una de las malignidades más comunes en hombres mayores de 50 años. Este cáncer causa obstrucción del tracto urinario Y generalmente hace metástasis en pulmón y hueso. No parece que existan grandes diferencias étnicas el este tipo de tumor; tal vez si existe variaciones étnicas en factores endógenos tales como el metabolismo de andrógenos, así como existe la hipótesis de la existencia de una susceptibilidad heredada el este tipo de neoplasia.

Siendo la próstata no visible o fácilmente asequible a un propio examen, hace difícil el que detectada a tiempo la presencia un tumor do próstata. Además, obstáculos como ineficientes modelos de cultivo celular para cáncer de próstata, un crecimiento bastante lento de estos tumores in vitro, bajo índice mitótico, etc., han retrasado los estudios citogenética convencional en esta tumorogenesis. No obstante, existen estudios citogenéticos que reportan cambios citogenéticos en tumores primarios de próstata, y el modelo de los cambios cromosómicos que surgen a lo largo de esta enfermedad está empezando a delinearse, así como la de ciertos genes involucrados en la etiología de la misma tales como aquellos que regulan el anormal crecimiento celular, muerte celular así como activación de protoencogenes (Brothrman, 1999).

Técnicas de citogenética molecular especialmente hibridación in situ con fluorescencia (FISH), hibridación comparativa de genomas (CGH), han sido referidos el varios reportes que señalan aberraciones específicas en esta neoplasia y parecen ser al igual que SKY (spectral karvotvpc imogirring) herramientas poderosas en el annálisis de cariotipos conplejos en malignidades como ésta.

En el presente proyecto, el objetivo principal de esta investigación fue el establecimiento de cultivos a corto plazo de tumores primarios de próstata, usando técnicas de citogenética convencional. Pudo verse así que los cromosomas 1,4, 5,12,15,19 e y estuvieron involucrados en los tumores primarios en el estudios posteriores investigaciones necesitan ser realizadas en este tipo de tumores puesto que su valor en la prognosis y diagnosis temprana será de gran utilidad en el manejo de esta enfermedad

SUMMARY

Cytogenetic studies have been instrumetal in the characte ritation of mulple cancers. While hematological malignancies have been extensively studied and cytogenetic analysis are now considered a routine, chromosomal studies of solid tumors continue to lay behind, and the intepretation of cytogenetic abnormalities in many epithelial tumors remains difficult (Brothman, 1999).

Prostate cáncer has become one of the most common malignancies in men. It causes obstruction of the urinary tract and occurs most commonly ill moll around 50 years- old. It seems unlikely that the large ethnic diferences in prostate cancer risk can be explained completely by ethnic diferences in diet or other life style characteristics. Instead, the difjerences may be due to ethnic enelcigc°noll.s /trcwr.r, such as androgen metabolism or they might be elite lo inherited susceptibility.

Being the prostate not visible or easy available lo self examination can cause the discase not easy lo be detected on time. Besides this, obstacles such as inefficient cell culture models for prostate cancer; slow growth of these tumors in vitro, low mitotic index, etc. have hindered conventional cytogenetic analysis ill prostate cáncer. However nowadays, a fairly amoulit of data has been generated regarding cytogenetic changes in primary prostate tumors, and a picture is beginning to emerge suggesting, that certain chromosomes are involved in the etiology of this disease and likely heirbor genes of importance for the regulation of normal cel growth (as in the minor suppressor genes), cel death (involving apoptotic pathways) or the activation of oncogenes (Brothman, 1999).

Molecular cytogenetic techniques especially fluorescence in situ hybridzation or comparative genomic hybridization resulted in various reports regarding specific chromosomal aberrations in prostate cancer and they seem to be powerful tool in the analysis of complex karyotypes in maligmmcies lo prostate cancer.

In this project primary prostate tumors were examines with conventional cytogenetic technieques. The main aim of this research was the establishment of short term culture of prostate tumors using cytogenetics in order lo characteric which chromosomes are involved during the course of this maliginancyc.

In the present study we found involvement of chromosomes 1,4, 5 y 12, 15 and 19. More studies need to be done in primary tumors because the knowledge of recurrent chromosomal changes and their diagnostic/ prognostic value in prostate tumors will allow us lo detect cgenetic value of individual changes.





II. INTRODUCCIÓN

El cáncer de próstata ha llegado a ser una de las malignidades más comunes en hombres mayores de 50 años, causando obstrucción del tracto urinario. Esta enfermedad la presentan un tercio de los estadounidenses, con un estimado de 244,000 nuevos casos en 1997 (Shibata, 1977) y un proximado de 300,000 casos en 1996 (Volgestein, 1998).

Diferencias sustanciales las presentan los negros, con una mayor tasa de esta enfermedad y con tasas 3 veces más halas en Japón. El incio de este cáncer es la formación de una lesión identificable histológicamente. Afortunadamente, la mayoría de estas lesiones no progresan en tumores detectables clínicamente. El cáncer de próstata se desarrolla en dos regiones diferentes de la glándula con muchas lesiones encontradas en la periferia (75 a 80%), en donde la mayoría de la glándula presenta lesiones múltiples. Y en la periuretral, calificada como la zona de transición. Es en esta región en donde ocurren procesos de hiperplasia benigna. La neoplasia prostática intraepitelial o PIN es el término dado por caracterizar células displásicas ductales y acinares, las mismas que se cree son las lesiones precursoras en cáncer de próstata (Volgestein, 1998).

Factores como el hecho de que la próstata no es fácil de detectar en un autoexamen o no esta visible, así como lo silencioso del desarrollo do los síntomas hacen que la enfermedad sea detectada cuando el paciente presenta dolor de huesos, lo cual está relacionado con un avanzado de la enfermedad. Sin embargo esta situación ha cambiado notablemente con el uso del PSA (antígeno específico de suero de próstata) como una herramienta de screening, la cual combinada con el examen tacto rectal y ultrasonido transrectal, abren la posibilidad de que se pueda detectar este tipo de cáncer que se encuentra confinado aun en la glándula (Volgestein, 1998).

PSA es una protesa con especifidad para la quimiotripsina, siendo secretado por la próstata en grandes cantidades dentro del plasma seminal. Normalmente el nivel de PSA en sangre esta bajo los 4 mg/mL, aunque este valor varía con la edad. Estos niveles también varían en situaciones de patología en próstata, y de una manera bastante dramática en carcinoma de próstata. Intensa investigación esta siendo hecha para interpretar que valores elevados pueden ser indicativos de una hiperplasia benigna o de un carcinoma. La detección de PSA en suero después de una prostatectomía u otro tratamiento para cáncer de próstata es una indicación bastante confiable de el progreso de esta enfermedad.

El cáncer de próstata esta clasificado en estadios de acuerdo a los patrones de arquitectura del tejido de acuerdo al sistema de DF Gleason. Debido a la heterogeneidad morfológica común, dos diferentes grados GLEASON. El estadio esta dado usando la clasificación TNM (tumor, node, metástasis).

Hallazgos citogenéticos de muy pocos tumores de próstata han sido reportados. Sin embargo pérdida de los cromosomas 1,2,5,8,10,16,17 e Y así como la ganancia del cromosoma 7, 14,20 y 22 han sido dados en los trabajos de Brtohman (1999). Trisomía de cromosoma 7 ha sido ligado con metástasis en este tipo de neoplasia (Bandyk et. Al; 1994).

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Para estudiar cáncer de próstata, tejido relativamente puro fue movido de la glándula, en forma aséptica e histológica y transferidos a una facilidad de cultivo celular, estableciéndose tumores primarios.

Los tumores fueron obtenidos del TORONTO HOSPITAL en Toronto, Canadá. El estudio de los tumores era T2 T2a.

En nuestro caso, se usó medio F2 (Can ser. Cat. Number CS-CD8-500), con un suplemento de 15% de suero fetal bovino (FBS. Gibco BRL. cat Number 16000-0144) 3mg/ ml -L - glutamina (L-glutamina. 200 nM. Gibco, cat Number 25030-149). 10 ng-ml epidermal growth factor, human recombinat 100 ug (1.0 mg/ml). Gibco cat. Number 25030-149, 10 6 M hidrocortisona (hydrdocortisone water soluble. H0396 Sigma), 1 ug/ml de selenato de sodio (sodium selenite. SIGMA), 20 ng/ml de diidrotestosterona (5 alpha dihydrotestosterone, D 5027 SIGMA, 101 mg/ml). Y penicilina (400 U/ml) con estreptomicina (400 ug/ml), la separación enzimática de las células epiteliales de los fibroblaslos fue hecho con colagenasa tipo IV (solución stock. colagenase tipo IV, 2000 U/ml. 5% pen-strep, Gibco cat. Number 1714-019). El tiempo de use de la colagenasa fue entre 13 a 16 horas.

La suspensión de células tumorales fue diluida hasta una concentración final de aproximadamente 100 o más células por cada 5 ml de medio de cultivo en frascos T25 y todos los frascos como cubreobjetos posibles fueron establecidos y mantenidos a 37 grados centígrados en un ambiente 5% de CO2. no siendo tocados en absoluto por dos días, siendo examinados únicamente para ver la adherencia de las células al cubreobjetos o al frasco.

El medio que contenía células no adheridas y que provenía de estos frascos y cubreobjelos en placas petri, fue transferido a otro frasco y reincubado para permitir un posible crecimiento de las células en suspensión, en lugar de ser desechado. Algunas veces se hizo la centrifugación de este medio el tubos cónicos de 15 ml. procediéndose a agregar colcemid (10 ug/trnl GIBCO BRL, cat Number 15210'040), por 2 horas. En el caso de cubreobjetos, 10 ul de colcemid fueron agregados por 3 ml del medio contenido el las placas petri, por espacio de 4 horas. La solución hipotónica (0.31% NaCl) fue puesto a 37 grados C al menos 30 minutos antes de la cosecha.

Las células fueron prefijadas con carnoy y colectadas por centrifugación a 1200 RPM por 10 minutos. El sobrenadante fue removido y luego las células fueron resuspendidas may suavemente en carnoy fresco. Este paso fue hecho dos veces.

Los cromosomas fueron prefijados en láminas, por cosecha in situ o por goteo procediéndose luego a la deproteinizacion con tripsina (trypsin EDTA, Gibco BRL, cat. Number25300-054) por 2 minutos, 15 segundos. Estas láminas fueron envejecidas en un horno a 90 grados C por 45 minutos. Finalmente fueron bandeados con bandeo G. Sumergiéndolas en solución Wrigh's Giemsa (Sigma, cat Number W-3000) por 1 hora 30 minutos.

Las células fueron analizadas y los cariotipos fueron hechos tratando de determinar las aberraciones cromosómicas no clonales y clonales.

IV. RESULTADOS 

Case Number 7
Source: TTH
Stage: T2a
CV
Karyotype: Composite
19x 46,XYM 1x46, XY, der (1), - 9,der ( l5), der (19)

Case number: 08 ounce: TTH
Stage: T2a
CV
Karyotype: 47, XY; der (1), - 3 +2markers.

Case number: 10
Source: TTH
Stage: T2a
CV
Karyotype: Composite
46,XY, +so 5p, -15, -18, +2-3
markers/45,X, -Y.

Case number 13
Source: TTH
Stage: T2
Karyotype: Composite
1 x 47, X, -Y, +3, +15, 1 x 45, X, -Y,
der (12)

Case number: 19
Source: TTH
Stage: T2a
CV
Karyotype: Composite
42,x, -Y; del(4p), -6, -6, -14, -21/ 45, X, -Y;-1 , DEL (4p), + 14, + marker.

Case number 20
Source: TTH
Stage: T2
Karyotype: Composite
1 x 47, X, -Y, +3, + 15/1 x, 45, X, -Y, der (12).

V. DISCUSIONES

Los datos obtenidos en este trabajo muestran correlación con los reportados en la literatura. Hallazgos con citogenética convencional han indicado anomalías cromosómicas que incluyen pérdida de los cromosomas 1, 4, 6, 8,12,14. 15,17-21 e Y, como la ganancia de los cromosomas 3,4 6-8,12, 14, 18-20 X e Y, y rearreglos o delecciones que involucraban a los cromosomas 7q. 9q y 10q . Cromosomas en doble minuto fueron vistos también en ciertos tumores reportados en la literatura. Un número de varias copias del cromosoma 8, raras selecciones en 10q24-25, isocromosomas 17q han sido, vistas en adenocarcinomas prostático con metástasis (Brothman 1997).

Brothman ( 1999) remarca que la región 1q24-25 está involucrada en estadios tempranos, y las regiones 6q14-q21. 8p22. 17q21 en estadios tempranos o grados bajos de cáner de próstata. Asociados con alto estadio son 5q21, más 7.7q31, más 8p21, 8p24, 10q-24. Relacionado con metástasis son IIpl3, 16q22-24. 17p y Xq 11-1 3.

Konig et al. ( 1998) estudiaron 39 carcinomas de próstata usando técnicas de cultivo a corto plazo. En este estudio, todos los 39 cariotipos obtenidos mostraron cariotipos de 46 XY con aberraciones clonales (8 casos) y con aberraciones no clonales involucrando) 2p. 3q. 11p, 17p y 21q. Las aberraciones numéricas encontradas por este grupo reportaron más 8 cromosomas en doble minuto y pérdida del cromosoma. Y loa hallazgos no clonales más frecuentemente observados fueron seleccionados en Sp, en cinco casos, y pérdida de los cromosomas 6,7,8,15,17,18,21 e Y en cinco casos.

Ozen et al. (1998), encontraron alteraciones estructurales del cromosoma 5 en 1 casos de líneas celulares de cáncer de próstata. Anomalías del cromosoma 5 se han reportado en desórdenes mielodisplásicos tales como anemia refractaria, leucemia mieloide aguda y en tumores colorectales.

Tricoli et al. (1999)reportan pérdida del cromosoma Y, la misma que también ha sido reportada en hipertrofia prostática benigna.

Los estudios de CGH indican ganancias en los cromosomás 1q, 2p, 3q, 7q, 9q, 11 p, 16p, 20, 22 y X y pérdida de material genético en los cromosomas 2q, 5q, 9p, 13q, 15q, 17p y 18q (Brothman, 1997). La información dada par CGH nos pace ver que existe mayormente una perdida de material genético, antes que ganancia del mismo.

Xu et al. (1998) reportan la evidencia de un locus a la susceptibilidad a cáncer de próstata en el cromosoma Y- Visarkopy et al. (1995) demos que un 30% de tumores de próstata provenientes de pacientes en donde había fallado la terapia hormonal estaban caracterizados por un número incrementado de la región en el cromosoma Xq11-q13 , la misma que contiene el receptor de andrógeno. Esto sugiere que los tumores de próstata podrían ser supersensibles en andrógeno , pero por un mecanismo no determinado aún, o quizás sensibles a una hormona esteroide no androgénica (Volgestein 1998).

La identificación de un nuevo gen supresor tumoral en el cromosoma 12 ha sido reportado también por Luu at. A1 (1998), la misma que parece suprimir un paso temprano en la cascada de metástasis.

Gao et al. (1999) han encontrado que la región del cromosoma 19p.13.1-13.2 contiene tumores supresores potenciales para esta neoplasia.

Como podemos ver, muchos más estudios necesitan ser realizados en tumores primarios de próstata, tumor difícil de crecer in vitro. Los cilogenetistas necesitamos trabajar en esta clase de tumores debido a que es todavía poca la información que se tiene al respecto, si lo comparamos con las malignidades hematológicas. El próximo paso en nuestra investigación será el uso de SPECTRAL KARYOTYPE IMAGING, SKY con el fin de caracterizar a los cromosomas marcadores encontrados en los cariotipos complejos de tumores de próstata. 

UNIVERSITY HOSPITALS CANCER CYTOGENETICS PROGRAM

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