| Acta Cancerológica.
Vol. 30 • Nº 1 • julio 2000 |
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GENOTIPO DEL VIRUS HTLV-I DETECTADO POR PCR EN
LINFOMA DE
CÉLULAS T PERIFÉRICO: REPORTE DE UN CASO
Dra. GUERRERO Ivonne*, Bach. VELAZC0
Rodolfo*, Dr. RODRIGUEZ Wilber*
RESUMEN
La etiologia viral ha sido asociada con la patogénesis de loslinfomas,
y el retrovirus linfotrópico de células T del humano "HTLV-1" aislado de
leucemias y linfomas de células T ha determinado el signifcado del virus en esta
neoplasia.
Nosotros reportamos un caso en el cual hemos determinado y caracterizado la prescencia del
genotipo viral del "HTLV-1" en un paciente con leucemia-linfoma de células T
periférico diseminado (ATL). El ADN fue aislado de sangre periférica y examinado para la
prescencia de virus de leucemia de células T del (PCR) cebadores tipo uno mediante
método de alta sensibilidad como la reacción en cadena de la polimeraza (PCR), usando
cebadores tipo específico. Una bomba de 18.5 pares de bases (pb) fue amplificada y
finalmente determinada para HTLV-1 por análisis de restricción específica.
La genotipifición viral rerportada por el análisis molecular PCR en este caso de linfoma
de células T oeriférico, infiere la posibilidad la posible acción transformante e
inmortalizadora inducida por virus en esta paciente por lo cual se hace necesariomayor
investigación que contribuya a determinar el rol patogénico del HTVL eN nuestra
casuística.
Palabras clave: HTLV-1, PCR, ATL
SUMMARY
The viral etiology has been associated with the pathogenesis of the
lymphomas, and the lymphotropic retrovirus of T human cels "HTLV-1 " isolated of
leukemias and lymphomas of T cells have determinated the significance of the virus in this
neoplasia.
We reported a case in the wich we leave detemiated and charatized the presence of the
viral genotype of HTLV-1 in ti patient with T cells disseminated lymphoma (ATL). The DNA
was isolated from peripheral blood and examinated for the presence of the human T-cell
leukemia virus type 1 applyng a 185 sensibility metod as the polymerase chain reaction
(PCR), using type spacific primers. A band of 185 base pairs (bp) was amplified and
determinated for HTLV-1 by specific retriction analysis. The viral genotipification
reported by the molecular analysis PCR in this case of T cells lynphoma, infor the
possible transfomant and immortalizing action induced by the virus is in this parient by
the wich is nessary major investigation to contribute to determine the pathogenic role of
HTVL in our casuictic.
Key words : HTLV-1 , PCR, ATL.
INTRODUCCIÓN
Varias clases de virus causan cáncer en humanos, aproximadamente entre
10 y 201, del cáncer en el mundo, y de ellos se calcula que los retrovirus constituyen
entre el 8-10% de el total. Los virus del cáncer humano como así se les conoce incluyen
al papilomavirus humano, virus de la hepatitis B o C, virus de Epstein Barr, herpes virus
asociados al sarcoma de Kaposi y el virus linfotrópico de células T del humano
"HTLV" (2) cuyos Factores de riesgo, de este último, para adquirirlo consideran
a la infección post-zigótica, lactancia materna, transfusiones con sangre contaminada y
relaciones sexuales (4,12). Estos virus induetores de cáncer alteran la maquinaria de la
célula infectada para promocionar su propia sobrevida y crecimiento, durante estos
procesos ellos interfieren con el mecanismo de control normal de la célula, permitiendo
su crecimiento anormal, alteraciones genéticas y malignidad. El virus HTLV-1, el primer
retrovirus humano en ser descubierto y aislado de una línea celular linfoblastoide de un
paciente con linfoma cutáneo de células T del sud-este de Estados Unidos, tienee un
genoma de aproximadamente 9000 pb y se le asocia con la leucemia aguda de células T con
características de hipercalcernia y lesiones de la piel después de machos años de
infección crónica de células CD4+ y con la mielopatía progresiva crónica. Por el
contrario HTLV-11 ha sido ligado a algunos casos de leucemia de células peludas, e
infección de la población de células CD8+ (5); aunque in vitro ambos tipos de virus
transforman células T CD4+.
El virus ha sido secuenciado y sujeto a intense examen biológico molecular, con
resultados que lo involucran con el importante evento
de inmortalización de los linfocitos (1). Los genes de este virus no son homólogos de
oncogenes celulares y no hay evidencias que sugieran mutagénesis por inserción, estos
genes alteran la expresión de una variedad de genes celulares y lo hacen alterando las
características de crecimiento de la célula huésped asociado a linfoproliferaciones
benignas o a linfomas y leucemias.
Es necesario mencionar que la definición del determinante genético viral responsable del
diferente tropismo y patogenicidad que presentan in vivo puede proporcionar las bases de
un entendimiento de la oncogenicidad del HTLV-1, motivopor el cual decidimos estudiarlo en
esta paciente aplicando necesariamente para su detección una metodología altamente
sensible corno la reacción en cadena de la polimerasa, con cebadores tipo específicos,
capaz de detectar un genoma viral en 10 a la seis células y fácil de ser usada para el
manejo de casuísticas grandes en estudios posteriores.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se estudio el genotipo del virus HTLV-1 en una paciente de 69 años de
edad, natural y procedente de Ayacucho, atendida en el departamento de Medicina del
Instituto de Enfermedades Neoplásicas "Dr.Eduardo Cáceres Graziani", con
diagnóstico de linfoma de céllas T periférico diseminado, primario extraganglionar del
fémur.
Extracción del ADN- El material biológico para la detección del genotipo HTLV-1
empleando la PCR lo constituyó una muestra de sangre periférica de la paciente.
Se aislaron linfocitos de la sangre periférica con Ficoll (Pharmacia). El ADN fue
extraído de acuerdo al método estándar ( 13), sometido a digestio enzimática con una
proteasa y un detergente al 20% se purificó el ADN con fenol: cloroformo : alcohol
isoamílico se precipitó con etanol, liofilizó y resuspendió con 100 ul de TE. La
cuantificación del ADN se realizó empleando un espectrofutómetro (MBA 2000-PE).
Reacción en cadena de la polimerasa PCR-
La mezcla de reacción se preparó en un volumen de 100 ul bajo las
siguientes condiciones : 100 pmol de each cebaelor. 200 mM de dntp,2.5 U de amplitaq DNA
pol. Lug de ADN, buffer PCR IX y 3mM de MgC12. Se sometió it 30 ciclos de amplificación
constituidos por: 94° durante 1 min, 50°C por 2 min y 72°C por 2 min. Una alicuota del
producto de amplificación y de un marcador de peso molecular conocido fueron corridos en
un gel de agarosa al 4% y coloreados con bromuro de etidio. Un fragmento de 185 pb fue
obtenido para el producto de amplificación del segmento del gen pol del HTLV-1 (Fig. 1),
y un fragmento de 260 pb para el producto del gen de la beta globina humana come control
del ADN genómico. Se emplearon controles virales de amplificación positivo. negativo y
blanco conocidos.
Análisis de restricción
El producto do amplificación obtenido de la muestra y control positivo fueron sometidos a
clivaje de restricción empleando la enzima de restricción RsaI y correspondiente
análisis electroforético de los sub-productos en geles de agarosa.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
Nosotros describimos el hallazgo molecular del virus HTLV-1 en un caso
de una paciente que consultó por dolores articulares, fractura patológica del fémur
izquierdo y múltiples nódulos cutáneos, presentando la biopsia de uno de ellos
infiltración por linfoma de células T periférico CD3 + y CD20 -, médula ósea
infiltrada por células neoplásicas y estudio de sangre periférica dentro de límites
normales. El survey óseo radiológico mostró osteopenia marcada en la columna dorsal y
lumbar, además extensa lesión osteolítica del fémur derecho. Su ecografía abdominal
fue negativa y la radiografía del tórax mostró algunas imágenes mal definidas en ambos
campos pulmonares sugesivas de proceso inflamatorio. Análisis negativo para sífilis, HIV
y antígeno de superficie de la hepatitis B. Siendo además el estudio de HTLV-1 por el
método de ELISA negativo. Con el diagnóstico de Leucemia Linfoma de Células T del
Adulto, la paciente inició su tratamiento con quimioterapia.
(CHOP) y posterior tratamiento paliativo con radioterapia y sintomáticos, su evolución
fue desfavorable y falleció. Con este antecedente clínico y conociendo que dos son las
familias de virus que con tribuyen al proceso de linfomagénesis en humanos (14,8), y de
ellas los retrovirus, como el virus de la leucemia de células T (3), intervienen como
agente causal de la leucemia o del linfoma de células T del adulto como nuestro caso,
reportamos el hallazgo molecular de la carga viral que identificamos en el paciente.
Aunque El mecanismo específico de transformación de las células T mediado por el virus
HTLV-1 no está aún claro, se supone que otros Factores adicionales podrían estar
involucrados en el proceso completo de leucemogénesis (9), insinuándose en algunos casos
la posibilidad de algún otro favor viral en estos eventos.
Se conoce que los linfocitos B pueden portar al virus de Epstein Barr como episomas y
expresar proteínas codificadas (10,6), infectar policlonalmente y estar sometidos a
mecanismos de control humoral y celular, y a pesar de ello poder mantenerse integrados o
no integrados a las células B o como en pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida permitirse la conversión de policlonal a oligoclonal y finalmente malignidad
monoclonal; observamos muy por lo contrario al virus de la leucemia de células T cuya
distribución geográfica de este se restringe por su tropismo a las células T como el
caso del linfoma que reportamos en el que se detecta el ADN del HTLV-1, el cual se;
integra monoclonalmente, estando sus proteínas y las sustancias inmunosupresivas
produciéndose como lo reportó Purtillo para este virus en linfomas malignos (11). Es
importante mencionar algunos de los eventos de la infección viral de las células T,
tales como la influencia de esta infección sobre las proteínas mayores involucradas en
la fase G0-G1 del ciclo celular y el efecto que causa la infección viral sobre la fase S
del ciclo en el camino patológico de los receptores de la interleukina-2 (IL2), Cuyo
marcador CD25 que se expresa cuando hay producción de IL2 no pudo ser estudiado por
citometría de flujo en nuestra paciente debido a la no viabilidad celular de la muestra.
Los receptores en la superficie de la célula que funcionan como vías para el HTLV-1 no
estan aún bien determinados, pero se conoce que éste puede infectar las células
productivamente e iniciar los cambios, moleculares mediante una proteína viral reguladora
denominada Tax la cual no sólo activa la expresión de los genes HTLV sino Que también
es capaz de inducir la expresión inapropiada de los genes celulares involucrados en la
proliferación celular, es decir actuar como un potente transactivador de sets de genes
específicos, pero por otro lado también se puede comportar como un trans-represor de
otro grupo de genes celulares. Esta proteína tax es inhibidora de la proteína supresora
de tumores p16. por lo cual Hiyake reporto que contribuye a la inducción de la leucemia
de células T amplificando la frecuencia de las mutaciones en el ADN cromosomal (7), lo
que nos permite inferir Que el virus para el caso del linfoma estudiado podría haber
inducido igualmente en el genoma celular mutaciones al azar responsables del fenotipo
tumoral, por lo que se hace necesario continuar estudiándolo.
Podemos concluir diciendo que el HTLV-1 contribuye a la linfomagénesis por
transformación de la maquinaria molecular de la célula huesped para desregular el
crecimiento y sobrevida de la celula y gracias a la gran sensibilidad y especificidad do
la reacción en cadena de la polimerasa para detectarlo, hasta ahora no sobrepasada por
ningún otro método para identificarlo y caracterizarlo, se hace posible y necesario
continuar estudiándolo en casuísticas mayores que nos permitan determinar su prevalencia
y el rol del HTLV-1 en el linfoma de células T periférico extraganglionar en nuestra
población.
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| FIG 1: PCR
para HTVL-1. Una película del producto amplificado fue corrido en un ángel de agarosa ,
se muestra la banda de 185 pb dle geln Pol. M(marcador de peso molecular), CP (control
positivo), CS (caso estudiado) |
Ver referencia bibliográfica
Correspondencia:
Dra Ivonne Guerrero, Centro de Investigación en Cáncer Maes-Heler, Instituto de
Enfermedades Neoplásicas. Av Angamos Este# 2520. Lima 34 . Perú.
Email: iguerrero@ inen.sld.pe
Telefax: 511-4483162 Teléfonos: 511-4483162 , 511-4499137 anexo 302
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Unidad de Biologia Molecular del Centro investición en Cáncer Maes-Heller *
Departamento de Medicina *. Instituto de Enfermedades Neoplásicas "Dr. Eduardo
Cáceres Graziani".
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