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Acta Cancerológica
© Sociedad Peruana de Cancerología y del Instituto de Enfermedades Neoplásicas.
ISSN versión impresa 1033-5545



Acta Cancerol.
    2005; 33 (1) : 28-34


GENES REGULADORES DE APOPTOSIS Y PROLIFERACION CELULAR 
EN MUJERES VIH POSITIVO Y CANCER DE CUELLO UTERINO

Ivonne Guerrero1, Luis Cuellar2, Luis 7axa4, Roberto Mejía1,Manuel Alvarez5
Julio Mariátegui5, Carlos Santos5, Romy Pizarro3, Mayer Zaharia6


RESUMEN

La apoptósis o muerte celular programada, es un proceso de eliminación celular que asegura el equilibrio entre proliferación y muerte celular. La pérdida de está estabilidad genética puede traducirse en el inicio y progresión de una neoplasia. Estudiamos por inmunohistoquímica (1HQ) la expresión de genes reguladores de apoptósis y proliferación celular en mujeres VIH positivo con cáncer de cuello uterino. Empleando la reacción en cadena de lapolimerasa ( I`CR ) se estudió el genotipo de los papilomavirus humano (PVH) 16, 18, 31 y 33.

BCL-2fue detectada en el 57. 1 %, no se detectó BAX en ningún caso. P53 se observó en el 42.8% y PCNA en el 71.4%. El ADN - PVHfue detectado en el 85.7%. El PVH-16 en el 57. 1 %, PVH-18 en el 28.5% y el PVH 33 en 14.28%.

En conclusión los eventos moleculares de la expresión de genes celulares reguladores de apoptósis y proliferación celular interrelacionan por vías diferentes, en la cascada carcinogenética de[ cáncer de cuello uterino, con los productos de [a expresión génica de la coinfección vira[ VIHPVH.

Palabras Clave: apoptósis, proliferación, VIH, PVH.

SUMMARY

The Apoptosis or programmed cell death is a process of cellular elimination that secure the balance between proliferation and cell death. The loss of the genetic stability can translate in the beginning and progressing of a neoplasm. We study by immunohistochemistry (IHQ) the expression of apoptosis regulators genes and cellular proliferation genes in positive HIV women and uterine cervix cancer Using the polymerase chain reaction (PCR) was studied the genotype of the human papillomavirus (HPV) 16,18,31 and 33.

Bcl-2 was detected in 57. 1 %, Bax was no detected in any of the cases. P53 was observed in the 42. 85lo, and PCNA in the 71.4%. DNA-HPV was detected in the 85.7%, HPV- 16 in the 57.1 Glo, HI`V- 18 in the 28.5% and the HPV-33 in ¡he 14.28%.

In conclusion, the molecular events of the expressíon of apoptosís regulators cellular genes and cellutar proliferation genes interrelation by differents pathways, in the carcínogenetic cascade of uterine cervix cancer with the products of the genetic expression of coinfection viral HIV-HI`V


Key words: Apoptosis, proliferation, HIV, HPY

 

En el proceso de transformación de las células normales a células cancerosas se presenta una cascada de alteraciones genéticas, como la pérdida del control de los mecanismos de replicación, reparación del ADN y segregación del material genético (21). La apoptósis es un fenómeno biológico cuyo proceso requiere del daño en una sola célula y participación activa de ella en su propia destrucción (24). Lo extraordinario es que se demuestra como la vida a nivel celular depende también de un proceso de muerte. Es importante, en la patogenia de varias enfermedades estudiadas hasta el momento dentro de las cuales podemos destacar las malformaciones, los trastornos metabólicos, neuropatías, lesiones miocárdicas, trastornos del sistema inmunitario y en el cáncer la ausencia de apoptósis se constituye en una característica.

Las enfermedades virales no son recientes, y más aún algunas de ellas se conocen desde la antiaüedad. Las epidemias por virus han ocurrido también desde épocas remotas, la plaga de Atenas en el año 430 AC, una de las primeras epidemias registradas, y con una mortalidad del 30%, la cual probablemente fue causada por el virus de la influenza. Actualmente, a pesar de los avances en medicina y de mejoras sanitarias, la mayoría de las infecciones virales no se han controlado aún. Cada ano se presentan epidemias ocasionadas por virus, infecciones cíclicas o esporádicas. Entre las infecciones endémicas por virus han sobresalido aquellas causadas por los papilomavirus, algunos virus de la familia herpesvirus y los virus de la hepatitis. En los últimos 35 años han ocurrido epidemias de origen viral con sintomatología no descrita hasta entonces; el caso más conocido es el del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), de distribución mundial y responsable del síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Aunque el rol de la infección por VIH en la patogénesis del cáncer cervical no es del todo entendible, hay estudios que han demostrado una gran prevalencia de PVH en mujeres serotipo positivo para VIH en relación a mujeres serotipo negativo, y más aún la prevalencia de PVH ha resultado ser directamente proporcional a la severidad de la inmuno-supresión medida por cuenta de CD4, (7, 3).

El comportamiento de los virus asociados a neoplasias, como parásitos intracelulares emplean la maquinaria celular provocando alteraciones responsables de la pérdida de su estabilidad genómica, de ahí la importancia del estudio de los productos de la expresión de los genes celulares como marcadores de expresión alterada que caracteriza determinada neoplasia.

El objetivo de la investigación fue estudiar la expresión de genes celulares reguladores de apoptósis y proliferación celular como bel-2, bax, p53 y pena y su interrelación con genes virales PVH-VIH, en mujeres VIHseropositivo y carcinoma epidermoide del cuello uterino.

MATERIALES Y MÉTODOS

arriba

Se estudió la expresión de cuatro genes celulares bel-2, bax, p53, pena por inmunohistoquímica y la presencia de los PVH de alto riesgo 16,18, 31 y 33 por PCR en siete pacientes con diagnóstico de carcinoma epidennoide del cuello uterino, serología positiva para VIH por el método de ELISA, tratadas con radioterapia, Tabla 1, atendidas en el Instituto Especializado de Enfermedades Neoplásicas de Lima Perú 1999-2001. El diagnóstico histológico fue realizado en cortes de tejido incluidos en parafina coloreados con hematoxilinaeosina. Fig 1.

Inmunohistoquímica

Se aplicaron anticuerpos por el método de peroxidasa anti-peroxidasa de acuerdo al protocolo del inserto. Para la proteína BCL-2 se empleó una dilución 1:50 (clona Bel-2-100), para BAX dilución 1:20 (clona 2D2), para P53 1:50 (clona DO-7) y para PCNA solución prediluida de segunda generación (clona PC 10).

La reacción inmunológica fue evidenciada con el eromógeno di arnino bencidina, observándose un color marrónen los casos positivos, de localización intra citoplasmática para BCL-2 y BAX y de localización intranuclear para P53 y PCNA. Se emplearon controles positivos y negativos conocidos para cada marcador.

Reacción en cadena de la polimerasa PCR

Para extraer el ADN del tejido incluido en parafina se obtuvieron cortes de 5 micras de espesor y desparafinados con xilol. Digestión enzimática con proteinaza K a 55' C en presencia de SDS. El ADN fue purificado con solventes orgánicos, precipitado con etanol absoluto, liofilizado y resuspendido en agua. La mezcla de reacción para la PCR contenía 5 microlitros de ADN, 50 pmol de cebadores E6E7, 1 X de buffer PCR 11, 3 mM de cloruro de magnesio, 2.5U de ADN polimerasa y 400 u mol de deoxinucleótidos.

El programa de amplificación estuvo constituido por un paso de denaturación a 95' C por F, hibridación de cebadores a 55' C por 2' y polimerización a 72' C por V durante 40 ciclos. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 4 % y coloreados con bromuro de etidio, correspondiendo una banda de 97 pares de bases (pb) para el PVH-31, 118 pb para el PVH- 18, 132 pb para el PVH33 y 134 pb para el PVH- 16. Los productos obtenidos fueron confirmados por el polimorfismo de sus fragmentos de restricción. para cada tipo viral.

La proteína BCL-2 fue detectada en 4/7 (57.1%), no se detectó BAX en ninguno de los casos. P53 se observó en 3/7 casos ( 42.8%) y PCNA en 5/7 (71.4%), Figs.2, 3. Tabla 2.

El ADN de los PVH fue detectado en 6/7 casos (85.7%). El ADN del PVH-16 se detectó en 4/7 casos (57.1%), el ADN del PVH-18 en 2/7 (28.5%) y el ADN del PVH 33 en 11 7(14.28%). El polimorfismo de los fragmentos de restricción obtenido confirmaron los tipos detectados, Fig.4, Tabla 3 

tabla 1:Histopatología, VIH y otras infecciones asociadas

Cada célula, tiene un tiempo de vida y un tiempo de muerte, conociéndose hasta el momento dos caminos por los cuales las células mueren, ellas pueden ser destruidas por agentes injuriosos ya sea daño mecánico o exposición a químicos tóxicos o ellas pueden ser inducidas a cometer suicidio por ejemplo por ruptura de su mitocondria con pérdida de citocromo e, por degradación de la eromatina o porque las células fagocíticas secretan citoquinas que inhiben la inflamación, eventos observados en

diferentes patologías entre las que se incluyen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida y, la neoplasia de cuello uterino. Este patrón de eventos en la muerte por suicidio es tan ordenado que el proceso es frecuentemente llamado muerte celular programada conocido también como apoptósis.

El factor frenador de la apoptósis más importante que se conoce hasta hoy es la familia de proteínas sintetizadas por el gen bel2. Nosotros reportamos una frecuencia alta de la proteína Bel-2 post radioterapia y

asociada a transformación, coincidente con los hallazgos de Harima quien correlacionó además, el incremento de la expresión de Bcl-2 después del tratamiento con radioterapia, con una sobrevida pobre (10) y Sheets relacionó su sobre-expresión con transformación y desarrollo de cáncer ginecológico(24).

Es interesante anotar que la familia de las proteínas bel se sintetiza justamente en la membrana de la mitocondria, jugando este organelo un doble rol pro y antiapoptósico, ya que tales proteínas disminuyen la permeabilidad de la membrana hasta bloquear el escape de citocromo e y de un factor inductor de apoptósis.

Los factores proteicos del gen bcl-2 se producen entre ambas membranas de la mitocondria. Los elementos sintetizados son: Bel-2, Bcl XL, Bcl W y BRAG. Estos factores son antiapoptósicos; pero mediante fosforilación originan proteínas con acción proapoptósica como: Bax, Bak, Bad y Bcl-5, produciendo una caída del potencial de transmembrana favoreciendo la liberación de citocromo e. Además actúan como activadores de las vías proapoptósicas Fas y del factor de necrosis tumoral y de algunas caspazas. Este es un claro ejemplo de reguladores pertenecientes a una misma familia de proteínas que actúan como pro o antiapoptósicos. Nosotros observamos ausencia de la expresión del gen regulador positivo de apoptósis, Bax, en este grupo de mujeres con cáncer de cuello uterino, VIB positivo y tratadas con radioterapia, contrariamente al hallazao de Ohno en carcinoma cervical, VIR negativo y tratadas con radioterapia en el cual reportó incremento de la expresión de Bax después del tratamiento lo cual asoció con apoptósis(20). Claramente podemos observar en los casos estudiados el mantenimiento de la supervivencia celular dada por el predominio de expresión del gen bcl-2 sobre el gen bax como ha sido reportado en la mayoría de los procesos tumorales por otros investigadores. Así mismo la elevada inmunoreactividad detectada para la proteína del antígeno de proliferación celular está en relación con la pérdida progresiva de la organización de la capa epitelial y como consecuencia relacionado también con el grado avanzado de la neoplasia (5,16).

Los virus desarrollan mecanismos por los cuales las células infectadas escapan de la eliminación apoptótica, en algunos de ellos se conoce que llegan a expresar en la célula infectada homólogos de la proteína bel2, la cual mantiene la viabilidad de la célula huésped mientras la infección se establece. En la interrelación cáncer, virus y apoptósis, algunos de estos virus que causan cáncer pueden usar estrategias para prevenir apoptósis de las células que ellos han transformado. Un ejemplo lo constituye el papiloma virus humano tipo 16 el cual ha sido implicado en causar cáncer cervical, produciendo la proteína E6 (23) que puede ligar e inactivar al promotor de apoptósis p53 lo cual inferimos que ocurrió en el caso HH4 del estudio, constituyéndose en un complejo E6PVH-P53 lo cual condujo a una rápida degradación de p53 mediante proteólisis dependiente de ubiquitina, perdiéndose la interrupción del cielo celular inducido por p53. Evidencias que sugieren que alteraciones en p53 y en los puntos de control producen inestabilidad genómica y sobre vivencia inapropiada de células dañadas, contribuyendo a la evolución de células normales a células malignas. El hecho de que p53 se encuentre mutado en muchos tipos de cánceres, como en la neoplasia del cuello uterino asociada a coinfección viral PVH-VIB nos suoiere que las anormalidades en los puntos de control de la fase GI a la fase S son muy importantes en el proceso de tumorigénesis (1 l); las ancuploidias y las amplificaciones de genes son comunes en células mutadas en p53 (15) indicando que la pérdida de la función de p53 está asociada a la inestabilidad genómica. La variante de la proteína p53 que contiene arginina en el codón 72 es muy sensible a la degradación indistintamente por las proteínas E6 de los PVH 16 ó 18 (13) como observamos ocurrió en los casos con carga viral del tipo PVH 18.

El producto del onco-en viral E7, del PVH-18 detectado en dos pacientes, se relaciona vía cielo celular con el desarrollo de cáncer genital, alterando la función de otra proteína celular supresora de tumor pRb la cual normalmente se liga al factor de transcripción E2F. La presencia de E7 resulta en un complejo E7pRb rompiéndose la unión E2F a pRb, evento que afecta la función de los puntos de control que operan en el paso de la fase G 1 a la fase S del ciclo, y permitiendo la unión de E2F al ADN lo cual induce crecimiento y proliferación, fenotipo alterado observado en la histología estudiada (12, 14, 4, 19). En relación a otras infecciones virales asociadas, como

el virus de la hepatitis B, este se asoció particularmente a la convivencia viral VIHPVH18 en dos casos, hallazgo que sugiere responsabilidad de carga viral mixta en la pérdida de la estabilidad genómica asociadas a p53, bcl-2 y PCNA. Mientras que el virus Herpes zoster se asoció a la convivencia viral VIR-PVHl 6 en un caso. Contrariamente otros virus, como el virus de la inmunodeficiencia humana, no causan cáncer pero se les encuentra asociados a determinadas neoplasias como al sarcoma de Kaposi y al cáncer cervical como en los casos que hemos estudiamos.

El VIB invade las células CD4+ muchas de las cuales mueren por apoptósis aunque el mecanismo aún no es del todo claro se postula que toman el camino de uno de los dos mecanismos por el cual la célula comete suicidio por apoptósis, aquel provocado por activadores de muerte, ligándose a receptores en la superficie de la célula entre los que se conoce al Fas ligando (FasL). En la infección por VIFL se conoce que tanto las células T infectadas como las no infectadas expresan Fas; por otro lado el gen Nef del VIB en una célula infectada provoca que ella exprese grandes niveles de FasL previniendo una interacción con su propio Fas que le cause su propia destrucción. Sin embargo, cuando la célula T infectada encuentra a una no infectada, la interacción de FasL con Fas sobre la célula no infectada la induce a ésta a la muerte por apoptósis evento biológico que se infiere en estas pacientes infectadas con VIH, donde la función de los linfocitos debilitados ha sido postulado también como un amplificador de la actividad latente o subclínica, resultando en una gran proporción de infección persistente(7). Aunque poco se conoce acerca de la historia natural de la infección de PVH en mujeres VIR sero positivas, algunos investigadores han reportado que una gran proporción de pacientes VIB + con cáncer cervical, adquieren la infección VIH después de la iniciación del proceso neoplásico y otros afirman que el carcinoma cervical invasivo puede tomar un curso clínico más aoresivo cuando se inicia en pacientes infectados por VIH (6,15,17,3), cualquiera de estas vías o si el VIH tiene un efecto sinérgico sobre la infección de PVH, ya sea por interacción inolecular directa o mediante un efecto inmunológico indirecto, permanece aún incierto, aunque una sobre regulación de la expresión de los genos E6 y E7 por proteínas de] VIH como TAT ha sido postulado por algunos investigadores(2). InclusoArany relaciona interesantemente un patrón de transcripción mas frecuente del gen E7 de los PVH en neoplasia peri anal a diferencia del patrón para el gen Ll observado en pene relacionado a niveles altos de la expresión TAT (1). Los genes E6-E7 detectados preferentemente en nuestro grupo nos obliga a estudios posteriores de los transcriptos con RTPCR y en una casuística mayor.

Nuestro estudio nos permite conclusiones y sugerencias, siendo el cáncer uterino como observamos una enfermedad con alteraciones en diversos genes en estadíos avanzado, terminal e incurable y conociéndose ahora que la aplicación de la terapia génica con genes supresores de tumores como p53 ha dado buenos resultados en cáncer de pulmón (22) y cáncer del cerviz (8, 18, 9), p53 representa experimentalmente un buen candidato para ser empleado por el terapeuta, especializado, como una nueva estrategia de tratamiento en un futuro cercano y la proteína bcl-2 importante en el camino apoptótico del cáncer cervical, cuya detección resulta valiosa como marcador biológico tumoral de progresión y pronóstico pobre porque interviene en la regulación del crecimiento mediando la muerte celular.

Finalmente, nuestro estudio evidencia que los eventos moleculares que dirigen la expresión de los genes celulares reguladores de apoptósis o muerte celular programada y proliferación celular en el cáncer de cuello uterino interrelacionan por vías diferentes con los productos de la expresión génica de la coinfección ó convivencia viral PVH-VIH favoreciendo la progresión de la cascada carcinogenética.

Agradecimiento: Los autores agradecen al Sr. Ricardo Castro, Gerente General de la Compañía GERY, por su valiosa contribución sin la cual hubiese sido imposible la culminación de esta investigación.

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1 Unidad de Biología Molecular Centro de Investigación.
2 Servicio de Infectología.
3 Servicio de Inmunología, 
4 Departamento de Patología,
5 Departamento de Ginecología y
6 Departamento de Radioterapia del Instituto de Enfermedades Neoplásicas.

Correspondencia: 
Dra. Ivonne Guerrero Alva, 
iguerrero@inen.sld.pe



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