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Acta Cancerológica
© Sociedad Peruana de Cancerología y del Instituto de Enfermedades Neoplásicas.
ISSN versión impresa 1033-5545



Acta Cancerol.
    2005; 33 (1) : 9-15


APOPTOSIS, PROLIFERACIÓN CELULAR Y HELICOBACTER
 PYLORI EN LA CARCINOGENESIS GÁSTRICA.

(ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO Y CORRELACIÓN HISTOLÓGICA EN 83 CASOS DEL INEN)

Guerrero Alva Ivonne1, Sánchez Lihon Juvenal2
Mejía Farro Roberto3, Celis Zapata Juan4


RESUMEN

El desarrollo del cáncer gástrico involucra tina serie de cambios en el genoma humano a nivel de oncogenes y genes supresores de tumores responsables de provocar inestabilidad genómica. La infección por Helicobacter pylori (HP) se asocia con la neoplasia gástrica aunque su rol
carcinogénico permanece aún desconocido.
Objetivos: asociar la expresión de las proteínas celulares P53, Bcl-2, PCNA y la presencia de Hp con el grado histológico de la neoplasia gástrica. 
Material y Método: se estudiaron en 83 biopsias gástricas de tejido incluido enparafina, 48 cairinonias de células "En anillo de sello " (CdeCAS), 2J adenocatrinomas tubular y papilar (ATP), 5 displasias y 9 gastritis, la presencia de las proteínas P53, Bcl-2, PCNA y fip, empleando un niétod6 ínmunoenzimático confracciones de inmunoglobulina purificada de anti-suero de conejo específico para cada marcador
Resultados: P53 se detectó en el 94% de los CdeCAS, 95% de ATP 40% de las displasias y 100% de las gastritis. Bel-2 se expresó en el 48% de los CdeCAS, 71 % de los ATP 80% de las displasias y en el 100% de las gastritis. PCNA se detectó en el 4617o de CdeCAS y 22 % de las gastritis. La frecuencia de Hp en CdéCAS y ATPfue del 42 y 43% respectivantente; en displasias el 20% y en gastritis el 100%.
Conclusión: La sobre-expresión de la proteína Bcl-2 se asocia a progresión de la neoplasia, y la bacteria Hp detectada mayormente en gastritis parece jugar su rol mas importante en los pasos iniciales de la inflamación crónica de la mucosa gástrica. Hallazgos que definen el importante rol carcinogénico que ejercen en la cascada de alteraciones de la biología de la mucosa del estómago asociada a la neoplasia gástrica.

Palabras Clave: P53, Bcl-2, PCNA, Hp.


SUMMARY

The develop of gastric cancer involve a series of changes in the human genome to level of oncogenes and tumors suppressor genes responsible of to produce genomic unstable. The infection by Helicobacterpylori (hp) is associated with the gastric neoplasm, although its role in the carcinogenic remain even unknown.
Objectives: Associate the expression of the cellularpioteins P53, Bcl-2, PCNA and the presence of the Hp with the histologyc grade in the gastric neoplasin.
Materials and Methods: We studied in 83 gastric biopsy of embedded paraffin tissue, 48 C de CA S, 21 A TP 5 dysplasías and 9 gastritis ). The presence of proteins P53, Bcl-2, PCNA and Hp, using a iminuno-enUmatic method with purified inimunoglobulínfractions of rabbits specific antiserum for each marker
Resuls: .- P53 was detected in 95% of CdeCAS, 95% in ATP 40% in dysplasia and 100% in gastritis. Bcl-2 ivas expressed in the 48% of CICdeCAS 71 % in ATP 80% in dysplasias and in the 100% of gastritis. PCNA was detected in the 46% of CdéCAS and 22% in gastritis. The Hp frequency in CdéCAS and ATP were 42 y 43% respectively; in dvsplasías 20% and in gastritis 100%.
Conclusion: Over expression of Bcl-2 proteins is associated to neoplasic progression and Hp bacteria high1y detected in gastritis appear play yours role more important in initiation step of chronic inflamination of gastric mucous, finding that explain the important carcinogenic role that exert in the cascade of alterations of stomach mucous biology associated to gastric neoplasm.

Key words: P53, Bcl-2, PCNA, Hp.

 

En Lima, el cáncer gástrico en el hombre ocupa el primer lugar con una incidencia del 20.5% y el tercer lugar en la mujer con una incidencia del 14.1 %, (17). La neoplasia gástrica como cualquier otra se desarrolla indudablemente por múltiples eventos biológicos asociados al medio ambiente y factores de riesgo capaces de alterar la homeostasis celular y provocar la inestabilidad genómica dando lugar a la iniciación y progresión de la cascada carcinogenética. Aunque aún no se definen los múltiples eventos de la carcinogénesis gástrica, algunos investigadores postulan alas alteraciones de los genes supresores de tumores como p53, activación de los oncogenes como k-ras, pérdida de heterozygocidad del gen bcl-2 involucrado en la progresión del cáncer bien diferenciado, o expresión aberrante de los sistemas de receptores de factores de crecimiento detectados tanto en carcinomas gástricos bien diferenciados como en los pobremente diferenciados, ( 23, 18, 26, 20).

Por otro lado, a inicios del año 1982 se le atribuye a Helicobacter pylori un rol causal en la ulcera gástrica, y en 1994 la Organización Mundial de la Salud la considera como un agente carcinógeno del grupo 1 para el hombre aunque hasta el momento no ha sido aceptado totalmente por la comunidad científica mundial.

La infección por Hp la cual puede persistir por años se la ha relacionado con cambios en la mucosa gastro-duodenal, tales como: gastritis crónica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, cáncer gástrico, tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT) y linfoma gástrico, infección asociada por estudios epidemiológicos con el nivel socio-económico bajo en la costa, sierra y selva de Perú, (16, 21). El riesgo de cáncer gástrico atribuible a la presencia de Hp ha sido estimada por Parra en un 70% en zonas industrializadas y en un 80% en países en vías de desarrollo, aunque también se reporta correlación entre la bacteria detectada en la mucosa gástrica y una gran prevalencia de afecciones

coronarias en los portadores, estudios en los cuales emplearon diferentes métodos para su detección (15, 14). Es probable entonces la interacción de la bacteria con proteínas celulares en la cascada carcinogenética de la neoplasia gástrica. El objetivo del estudio fue el de asociar la expresión de las proteínas celulares P53, Bel-2, PCNA y la presencia de Hp con el grado histológico de la neoplasia gástrica y determinar su importancia como marcadores biológicos empleando anticuerpos específicos mediante inmunohistoquímica.

MATERIALES Y MÉTODOS

arriba

Se estudiaron por inmuno-histoquímica las proteínas celulares P53, Bel-2, PCNA y Hp en las biopsias gástricas de 83 pacientes atendidos en el Instituto Especializado de Enfermedades Neoplásicas. El diagnóstico de los carcinomas gástricos se realizó de acuerdo con la clasificación histo-genética de los dos tipos principales: 1- carcinomas de células en anillo de sello (CdeCAS) y 2adenocarcinomas tubulares y papilares (ATP), (19). 48 pacientes con diagnóstico de CdeCAS, 21 ATP, 5 displasias y 9 gastritis crónica superficial. La edad promedio del grupo fue de 59 años, con una relación 1:1 para ambos sexos. 711 83 pacientes reportaron proceder de la costa. Tablas I, II.

Material Biológico:

Se realizaron cortes de 5 mieras de espesor de los tejidos incluidos en parafina correspondientes a cada caso en estudio. Los cortes fueron depositados sobre láminas previamente tratadas con poly-1-lisina y sometidos a procesos de desparafinado e hidratación adecuada de los tejidos.

Inmunohistoquímica:

Cada uno de los casos fue expuesto a anticuerpos, aplicando el método de peroxidasa anti-peroxidasa.(PAP) según el protocolo sugerido en el inserto del kit. El anticuerpo anti P53 - clona DO-7 se aplicó en una dilución 1:20. Para el anticuerpo Bcl-2 clona Bel-2-100 se empleó la dilución 1:50 y para el anticuerpo PCNA - clona PC 10, una dilución 1:20. El anticuerpo polielonal primario específico para Helicobacter pylori B0471 fue aplicado en una dilución 1:10. La inmunorcacción fue revelada para cada marcador con diamino-bencidina, observándose en los casos positivos la coloración marrón y localización correspondiente al marcador estudiado. Se consideraron controles positivos y negativos conocidos.

Inmunodetección:

Los microorganismos inmuno-reactivos en cada caso fueron identificados al microscopio óptico de luz por la coloración marrón que presentaron, localizados tanto en el mucus como en los acidos glandulares del estómago. El patrón de distribución característico de los casos positivos para las proteínas P53 y 'PCNA fue intranuclear, y para la proteína Bel-2 intracitoplasmático.

Se estudió la presencia de P53, Bel-2, PCNA y Hp por inmuno-histoquímica en los 83 casos de la muestra. La sobre-expresión de la P53 fue detectada en 45/48 (94%) casos de CdeCAS, en 20/21 (95%) ATP, en 2/5 (40%) displasias y en el 100% en gastritis (Foto 1). La proteína Bcl-2 se expresó en 23/48 (48%) de CdeCAS, en 15/21 (7 1 %) ATP, en 4/5 (80%) displasias y en el 100% de las gastritis (Foto 2).

La proteína PCNA inmunoreaccionó en el 46% de los CdeCAS y en el 22% de las gastritis (Foto 3). Hp se observó en el 42% (20/48) de los CdeCAS, en el 43 % (9/2 1) de ATP, en el 20%(l/5) de las displasias y en el 100% (9/9) de las gastritis (Foto 4). Tablas III, IV.

Como en la mayoría de los tejidos, la homeostasis de las células epiteliales gástricas se mantiene también por un balance entre proliferación y muerte celular programada o apoptósis. Las alteraciones de los eventos fisiológicos celulares que caracterizan las condiciones patológicas del estómago han sido observadas en los 83 casos de nuestro estudio. El incremento en el número total de células epiteliales proliferantes y la distribución anormal tardía son frecuentemente observadas por los patólogos en casos de gastritis crónica, atrofia gástrica, metaplasia intestinal, displasia o cáncer gástrico.

Los cambios en el número de las células epiteliales han sido asociadas fuertemente con la infección por Helicobacter pylori aunque su significado en la carcinogénesis gástrica es todavía controversial (24), a pesar de haber sido considerada por la OMS a través de su agencia para la investigación en cáncer (IARC) como un agente carcinógeno del grupo 1 para el hombre (5,11,6). Nosotros investigamos en este estudio su asociación y la expresión de p53 y bcl-2 en correlación con variables histopatológicas y proliferación celular empleando la inmunohistoquímica en la detección de estas proteínas celulares.

La muerte celular programada como proceso activo está genéticamente codificada y tiene un rol importante en varias actividades celulares, entre ellas el desarrollo embrionario y la homeostasis (4). Varios de los genes que regulan la apoptósis han sido reportados en diferentes patologías, incluyendo p53, uno de los genes supresores de tumores, y varias clases de genes relacionados a bcl-2. En los casos de gastritis que estudiamos la gran frecuencia de Bcl-2 detectada representa un evento común de sobre regulación del oneogén bcl-2 en las lesiones premalignas, hallazgo reportado también por otros investigadores (25). Muy por el contrario, la acumulación de la proteína P53 es menos frecuente en estas lesiones premalignas aunque puede encontrarse en algunos eventos como en metaplasia intestinal; probablemente en las gastritis que investigamos, la gran frecuencia detectada se asocie también a la presencia de la bacteria Hp a quien se le atribuye además un posible rol en la inducción de apoptósis mediante la producción de numerosas moléculas como la citotoxina Vac A, lipopolisacáridos, monocloramina y óxido nítrico en lesiones precancerosas como atrofia gástrica, metaplasia intestinal y displasia lo cual confirma la responsabilidad que se le atribuye a Hp de inducir inestabilidad genómica reportado también por otros investigadores (13) quienes mencionan además que la apoptósis inducida por Hp puede no ser por mucho tiempo dependiente del ciclo celular en esas lesiones debido a la ocurrencia de alteraciones y mutaciones de los genes reguladores de apoptósis, lo cual resulta en la pérdida del balance entre apoptósis y proliferación celular.

La presencia de la proteína de proliferación celular PCNA que describimos en las gastritis asociadas a Hp coincide con el incremento descrito por Anti (2) como un patrón usualmente observado durante la infección por Hp, el cual puede ser revertido si se erradica a la bacteria o de lo contrario su progresión a través de los pasos de iniciación de la carcinogénesis conducirá a la pérdida de la posibilidad de revertir. En el pequeño número de displasias que estudiamos detectamos proteína P53 sólo en las 2 displasias severas del grupo y en ausencia de Hp, mientras que la proteína Bcl-2 se inmuno-detectó en displasias de grado leve, moderada y severa probablemente interfiriendo la apoptósis, evento que ha sido reportado como frecuente en displasias (22). Por el contrario la proteína que identifica al antígeno común de proliferación celular no fue expresada en las displasias, observación totalmente opuesta a la inmuno-detectada en nuestros casos de carcinoma de células en "Anillo de Sello", comparación coincidente con la de Susuki quien reportó un número de células proliferativas significativamente mayor en carcinoma gástrico que en displasia.

En las neoplasias malignas que estudiamos la proteína Bcl-2 detectada fue preferentemente expresada en adenocarcínomas medianamente y pobremente diferenciados a diferencia de la experiencia de Tahara (23) quien reportó la sobre expresión únicamente en los adenocarcinomas pobremente diferenciados. Por el contrario coincidimos con la sobre expresión de Bel-2 que observamos en los casos de carcinoma de células en anillo de sello. Es importante mencionar que la expresión de Bcl-2 es un marcador considerado por Inada como un factor pronóstico importante de sobrevida en pacientes con cáncer gástrico avanzado (8) lo cual nos motiva a continuar investigando nuestra casuística.

También la expresión de P53 es considerada por Aizawa como el mas importante factor pronóstico de riesgo, siendo la apoptósis en carcinoma gástrico asociada con proliferación celular, y el incremento de su expresión como la frecuencia que detectamos asociada al antígeno de proliferación celular en carcinomas se asocia también al desarrollo de cáncer y podría por lo tanto tener importancia pronóstica y ser considerada como un predictor de respuesta a la quimioterapia (1, 3, 7, 9, 12), además Bcl2 como P53 han sido asociadas con la morfología deprimida o elevada del tumor (10).

Cuando observamos nuestros resultados con respecto a la sobre expresión del gen supresor de tumor p53 presente en los diferentes grados histológicos de la patología gástrica nos conduce a inferir el importante rol que tiene en la generación de cáncer gástrico con presencia o no de Hp. Es necesario mencionar que la apoptósis del epitelio gástrico es un evento fisiológico programado a nivel de mucosa, importante para mantener el número de células saludables, y debido a que la apoptósis regula el número de ciclos celulares en balance con proliferación, desregulación de apoptósis o proliferación provocada por la colonización de Hp, podría ser este un punto ligado a la carcinogénesis gástrica, es decir un nivel reducido de apoptósis podría contribuir a acelerar la generación del cáncer de estómago, estudios que posteriormente continuaremos a nivel molecular empleando métodos de mayor sensibilidad.

Resulta interesante resaltar un aspecto epidemíológico en la muestra investigada, la coincidencia en relación a la costa de Perú como región de nacimiento y procedencia que reportaron con mayor frecuencia los pacientes estudiados, lo cual podría estar asociado a variables de riesgo aún no determinadas responsables de la inestabilidad genómica traducida en el desarrollo y comportamiento de la enfermedad motivo también de otra investigación.

En conclusión, nuestros resultados indican la presencia de cambios genéticos múltiples en oncogenes, genes supresores de tumores y genes de proliferación celular, observados en el camino del desarrollo hacia el cáncer de estómago probablemente facilitando la progresión del tumor; y la bacteria Hp detectada mayormente en gastritis parece jugar su rol más importante en los pasos iniciales de la inflamación crónica de la mucosa gástrica, hallazgos que definen el importante rol carcinogénico que ejercen interactuando en la cascada de alteraciones de la biología de la mucosa del estómago asociada a la neoplasia gástrica.

Agradecimiento: Los autores agradecen a la Sra. T.M. Estela Aliano por su apoyo con la inmunohistoquímica y al Lic. Estadístico Claudio Flores por su contribución.

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1 Investigadora, Jefe de la Unidad de Biología Molecular del Centro de Investigación en Cáncer Maes-Heller del INEN. Lima - Perú.
2 Investigador, Jefe del Departamento de Patología del INEN. Lima - Perú.
3 Asistente de investigación de la Unidad de Biología Molecular del Centro de Investigación en Cáncer Mac-Heller del INEN. Lima - Perú.
4 Jefe del Departamento de Abdomen del INEN. Lima - Perú.



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