IDENTIFICACIÓN DE UNA NUEVA MUTACIÓN COMO CAUSA DEL SÍNDROME DE LESCH-NYHAN EN UNA FAMILIA PERUANA: UTILIDAD DEL EXAMEN MOLECULAR PARA EL CONSEJO GENÉTICO

 J. PATRICK O´NEILL¹, LUCY  TROMBLEY ¹ MARY GUNDEL¹ TIMOTHY HUNTER² JANICE A. NICKLAS³ MARIA ISABEL DE MICHELENA⁴

1. Genetics Laboratory.
2. DNA Analysis Facility. and
3. Molecular Diagnostics.Laboratory-  University of Vermont. Burlinton, VT 05401 USA, e
4.   Instituto de Genética Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima. Perú.

RESUMEN

En un niño con síndrome de Lesch-Nyhan (LN) se ha identificado una nueva mutación en el gen HPRT, ligado a X. Esta mutación puntual, un cambio de guanina por timidina (G ->T) en la base 40114 del gen da copio resultado la alteración del ARN mensajero (ARNm).y, consecuentemente, la falta de producción de la enzima hipoxantina­ guanina fosforibosiltransferasa, lo cual origina el síndrome de LN. La madre y algunas de las mujeres de la familia en riesgo de ser portadoras sanas (heterocigotas), también fueron estudiadas, encontrándose que la madre es heterocigotas pero las dos hermanas y  una tía materna no lo son. Esta información ha permitido el asesoramiento genético a estas mujeres, y podría, eventualmente, ser usada para diagnóstico prenatal.

Esta mutación no ha sido reportada antes en casos de Lesch-Nyhan, ni está descrita en la base de datos de mutaciones del gen HPRT humano, por lo que se ha denominado HPRT_PERU

SUMMARY

A new mutation in the X-linked hypoxanthine-guanine phosphoribosytransferase (HPRT) gene has been determined in a male afflicted with Lesch-Nyhan (LN) syndrome. This point mutation, a G->T tranversion at genomic base 40114 results in the alteration of mRNA, and, consequently in the lack of production of normal enzyme hypoxanthine­ guanine phosphoribosyltransferase, wich is the cause of LN syndrome. The mother and some of the female members of the family who were at risk for being healthy carriers (heterozygous) of the HPRT mutation were also studied. DNA sequencing revealed that the boy´s mother is a carrier of this mutation, but that his two sisters and one maternal aunt are not. Such carrier information has allowed genetic counselling for these women, and could eventually, be used for prenatal diagnosis. This mutation has not been reported previously in a Lesch-.Nyhan syndrome male nor in the entire human HPRT mutation. database, and has been termed HPRT_PERÚ.

PALABRAS-CLAVE: Síndrome de Lesch-Nyhan, Nueva mutación, gen HPRT.
KEY WORDS: Lesch-Nyhan Syndrome, New Mutation, HPRT gene.

INTRODUCCION

El síndrome de Lesch-Nyhan es un error innato del metabolismo de las  causado por la ausencia de la enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT) debido a mutaciones en el gen HPRT, situado en el eromosoma X (Xq26)^1-2. Las características de este síndrome son: parálisis cerebral espástica, coreoatetosis, cálculos urinarios de ácido úrico, disfunción neurológica y autoagresión compulsiva, incluyendo destrucción por mordedura de dedos y labios. Debido a que es una enfermedad ligada a X, sólo los varones están afectados, pero las mujeres pueden ser portadoras heterocigotas (sanas) y tener, por lo tanto, hijos varones afectados. Se ha estimado que un tercio de los varones con síndrome de Lesch-Nyhan representan mutaciones nuevas, mientras que los otros dos tercios han heredado el gen mutante de una madre portadora sana³.

Recientemente hemos descrito un método que puede ser utilizado tanto para diagnóstico como para análisis de la mutación del síndrome de Lesch-Nyhan⁴. Este método se basa en la capacidad de los linfoncitos T deficientes en HPRT para crecer en presencia de 6-tioguanina (TG), un análogo de la purina, que normalmente es citotóxico⁵. El cultivo de linfoncitos T en diferentes medios, unos con TG y otros sin dicho componente, permite la diferenciación entre personas con deficiencia de HPRT y las que no la tienen. Este método permite también la determinación del estado de portador de las mujeres en riesgo, y proporciona células para realizar el análisis del ADN.

MATERIAL Y METODOS

Sujetos:

La genealogía se muestra en la figura 1. El caso índice (V-3) es un niño que fue remitido para evaluación genética a los cuatro años y medio. Según anamnesis, este niño presentó retardo del desarrollo psicomotor desde el inicio; había sido diagnosticado de "parálisis cerebral" desde los 6 meses y nunca había podido sentarse solo ni caminar. Además, durante los últimos 2 años había presentado, con severidad progresivamente mayor, conductas agresivas y autoagresivas (se mordía los dedos hasta hacerlos sangrar, por lo que se hacía necesario el uso casi permanente de guantes de box para protegerlo), así como movimientos involuntarios. Su vocabulario constaba de unas 15 palabras, pero su comprensión del lenguaje parecía mucho más amplia. Aun no controlaba esfínteres.

En el examen, se observó a un niño de aspecto atractivo, sonriente, que se mantenía sentado con apoyo. Su peso y talla eran adecuados para su edad y no mostraba rasgos dismórficos. Además de lo descrito por la madre, presentaba hipotonía axial y movimientos involuntarios de tipo coreo atetoide. Su conducta llamaba la atención, debido a que, estando aparentemente tranquilo, presentaba repentinos e inmotivados episodios de agresión hacia su madre y los médicos, escupiendo, pateando y tratando de morder. Entre los exámenes auxiliares, la resonancia magnética cerebral no mostró alteraciones significativas, pero se describían algunas zonas de desmielmización. Los análisis bioquímicos eran en general normales, excepto que el ácido úrico estaba ligeramente elevado en sangre 7.7mg/dl, normal: de 2.5 a7) y muy elevador en orina (127.5. normal: (te 15 a 20). La relación ácido úrico/ creatinina en orina de 24 horas era de 3.45 (normal de 0.6 a 1.5). Estos resultados y el cuadro clínico sugerían el diagnóstico de síndrome de Lesch-Nyhan. Para confirmarlo se hicieron los exámenes adicionales que se describen más adelante.

La historia familiar mostró que este niño (V-3 en la genealogía) es el tercer hijo; sus hermanas (V-1 y V-2) de 11 y 9 años, son sanas. Sus padres (IV-2 y IV-10) son consanguíneos en tercer grado, ya que las abuelas maternas de ambos (II-1 y II-2) eran hermanas. de ascendencia croata . El padre (IV-10) tiene 4 hermanas, todas sanas y aún sin descendencia; no hay historia de anomalías congénitas en esa rama de la familia. Su madre (IV-2) tuvo 8 hermanos: 6 mujeres y 2 varones. El mayor de los hombres (IV- 1) falleció a los 11 meses de edad, con un trastorno neurológico diagnosticado como "parálisis cere­bral" Y que. según su madre recientemente fallecida. era idéntico al M caso índice. Las 6 mujeres y el otro varón son sanos y aún sin descendencia. La abuela materna (M-1) fue hija única, y ¡lo hay historia de otras personas con trastornos neurológicos en la familia.

Análisis enzimáticos Y moleculares

Se tomó muestras de sangre del caso índice (V-3), su madre (IV-2), sus dos hermanas (V-1 y V-2) y una de las tías maternas (IV-8) . Las otras mujeres en riesgo de ser portadoras (IV-3 a IV-7) el, rehusaron hacerse el examen. Las muestras fueron tomadas en el Perú y remitidas a la Universidad de Vermont donde se realizaron las pruebas enzimáticas y moleculares descritas a continuación.

Análisis del clonamiento de linfoncitos T

Este examen se basa en la capacidad de los linfoncitos T  deficientes en HPRT para proliferar y formar colonias en presencia de 6-tioguanina (TG), un análogo de la purina que mata a las células normales. Para este análisis. se aislaron los linfoncitos T de las muestras de sangre. y se sembraron en diferentes medios de cultivo, de los cuales unos contenían TG y otros no la contenían. según métodos descritos previamente⁵. Posteriormente se analizó y cuantificó el crecimiento de colonias en cada uno de los cultivos. La prueba mide la producción de HPRT por las células cultivadas, ya que en este análisis, las células mutantes (HPRT-) deben multiplicarse y formar colonias. tanto en los medios de cultivo que contienen TG, como en los que no la contienen; en tanto el crecimiento tic las células normales (HPRT+) es inhibido por la presencia de TG en el medio de cultivo. La frecuencia de mutaciones se calcula con lo la resultante de dividir la cantidad de colonias obtenidas en un cultivo que contenga 10uM de TG. entre la cantidad de colonias en ausencia de TG.

Por lo tanto. las células de un varón con síndrome de Lesch-Nyhan. que deben crecer igualmente bien en presencia o ausencia de TG. darán una frecuencia de células mutantes de 1.0 (100%). En las células de una mujer no portadora se encontrará una frecuencia de mutaciones de 1 a 20x 10^-6 ( 0.000 1- 0.002%)⁶  Y en las de una mujer heterocigota, la frecuencia de mutaciones será de 0. 1 a 5%⁷ La frecuencia en las Mujeres portadoras es menos del 50% esperable. debido probablemente a la selección negativa contra las células mutantes durante la proliferación de las células hematopoyéticas primitivas⁸.

Análisis de la mutación HPRT

Para el análisis del ADN se utilizaron los linfoncitos obtenidos en los cultivos de la prueba anterior. Se sintetizó ADN clonado mediante transcriptasa reversa con el método descrito por YANG Y colaboradores^{9. Este ADNc fue amplificado por PCR, utilizando cebadores específicos para FIPRT, y luego secuenciado directamente utilizando un Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin El mer -ABI) y un secuenciador automático ABI modelo 373A con cebadores HPRTB and A (bases HPRT -36 to - 17 y 701 to 682, respectivamente).}

Para el secuenciamiento del exon 8 del ADNc genómico (bases 40033 a 40109) se utilizaron los cebadores 38667 a 38691 (con sentido) y 40199 a 40176 (antisentido), los cuales fueron desarrollados para amplificar los exones 7 y 8 del gen HPRT10 (Estos cebadores se numeran de acuerdo a la secuencia del gen HPRT genómico11).

RESULTADOS

En la prueba de clonamiento de linfoncitos T, las células del caso índice mostraron idéntico crecimiento en los cultivos con TG o sin ella, con lo que se demostró una frecuencia de mutación de 1.0 ( 100%), consistente con el diagnóstico de síndrome de Lesch-Nyhan. Su madre mostró una frecuencia de células mutantes de 1.1%, lo cual está dentro del rango esperado para las heterocigotas. Las frecuencias de mutaciones en las otras tres mujeres estudiadas en la familia (IV-8. V- 1 y V-2), estuvieron dentro del rango normal, esto es 2.9x 10-6, 2.3x 10-6 y 3.4x 10-6, respectivamente, por lo que estas tres mujeres fueron consideradas no portadoras de la mutación (tabla l).

El secuenciamiento del ADN clonado del ,en FIPRT en el varón afecto demostró la exclusión exacta y exclusivamente del exón 8. Al secuenciar el ADN genómico de la zona que incluye el exón 8 se encontró un cambio de bases en la secuencia donadora de procesamiento: la secuencia normal: gtaagt quedó sustituida por gtaatt (IVS8+5G->T; base genómica 40114G->T). Esta mutación interfirió con la edición normal del ARN mensajero, causando la mencionada exclusión del exón 8.

El secuenciamiento del ADN clonado de las células de la madre que crecieron en el medio sin TG (que son las que expresan el alelo normal; el mutante ha sufrido el fenómeno de mactivación) mostró la presencia del exón 8, y las 657 bases normales de la zona estudiada. En cambio. el secuenciamiento del ADN clonado de las células de la madre que crecieron en el medio con TG (que son las que expresan el alelo mutante; el normal ha sufrido el fenómeno de inactivación) mostró la exclusión del exón S. Para confirmar en forma absoluta la condición de heterocigota de la madre y evaluar la factibilidad de hacer el examen directo de ADN a las mujeres de la familia en riesgo, se secuenció la región del exón 8 del ADN genómico de la madre; se encontró un único cambio con respecto a lo esperable en la secuencia normal: se encontró tanto G como T en la base 40114. De esta manera quedó confirmado que ella es heterocigota para la mutación que presenta su hijo.

Un aspecto importante del análisis de la mutación en el síndrome de Lesch-Nyhan es la posibilidad de aplicar estos métodos para determinar el estado de portadoras en las otras mujeres en riesgo de la familia. Por ejemplo, en esta familia las otras tres mujeres estudiadas (IV--8, V-1 y V-2) habían sido consideradas como no portadoras por el examen de cultivo de linfoncitos T. Además de eso, se realizó el secuenciamiento directo del ADN genómico, el cual mostró en estas tres mujeres únicamente el tipo normal de ADN, con G en la base 40114, confirmando así que ninguna de ellas es portadora de la mutación (tabla l).

DISCUSION

La mutación reportada en esta familia no ha sido descrita antes en relación al síndrome de Lesch--Nyhan12,13 Sin embargo sí se ha reportado un cambio de G->A en la misma base dentro de la secuencia donadora de procesamiento, la cual tuvo idéntica consecuencia de exclusión del exón 8 en el ARNm; esta exclusión hace que la proteína producto del gen HPRT en estos casos sea más corta, de sólo 182 aminoácidos, ya que la pérdida de las 77 bases del exón 8 causa un desplazamiento del marco de lectura. que crea un codón determinación TAG en el nuevo codón 183.

Existe una gran base de datos de las mutaciones del gen HPRT14. Aunque las que afectan el procesamiento del exón 8 son frecuentes, esta mutación en particular, que, por el lugar de origen, hemos denominado HPRT_{PERU, no había sido descrita antes en dicha base de datos, y es sólo la segunda reportada en la secuencia donadora de procesamiento del exón 8.}

Respecto al origen y segregación de la mutación en esta familia, si aceptamos la hipótesis que IV--1 haya tenido también el síndrome de Lesch--Nyhan, debernos suponer que la abuela materna (M- I) fue una heterocigota para la mutación descrita, pero no hay suficiente información de generaciones anteriores que permita deducir si fue ella la primera persona con la mutación en la familia, o si su propia madre (II-1) fue portadora. En cualquier caso, cada una de las seis tías maternas del caso índice tiene una probabilidad de 50% de ser portadora sana; y aunque esto fue explicado a la familia, cinco de estas seis mujeres en riesgo rechazaron el ofrecimiento de conocer su estado de portadora. Esta negativa a dilucidar la presencia de un propio gen "malo", puede estar condicionada por factores psicológicos y culturales, y no es infrecuente15.

En las hermanas del paciente, quienes también tenían una probabilidad de 50%, la condición de heterocigotas fue descartada por los exámenes realizados. Debido a la ausencia de otros enfermos, para cualquier otra mujer de la familia, fuera de las hermanas y tías maternas del caso índice, la probabilidad de ser portadora es muy pequeña.

Otro punto que merece comentarse es la importancia de llegar a un diagnóstico preciso en niños con trastornos neurológicos no bien determinados. Muchos pacientes diagnosticados de "parálisis cerebral" tienen en realidad enfermedades neurogenéticas específicas, que deben investigarse, tomando en cuenta los beneficios potenciales que la determinación de un diagnóstico específico aporta para ellos y sus familias. Para la obtención de este diagnóstico se requiere seguir un proceso, el cual se inicia con el establecimiento de la sospecha clínica, y culminaron el examen directo del gen (o de los cromosomas en otros casos), a fin de identificar el defecto genético específico causante del trastorno.

Este reporte muestra la importancia de la combinación de la determinación de frecuencia de células mutantes y el análisis molecular del gen HPRT tanto para el diagnóstico del síndrome de Lesch-Nyhan, como para el consejo genético de las mujeres en las familias en las que se diagnostica este síndrome. En esta familia, la consecución del diagnóstico etiológico permitió que tres mujeres se beneficiaran de la certeza de que ellas no transmitirían a sus hijos la mutación causante de este grave trastorno. Y los padres del paciente tie-nen actualmente la posibilidad de optar por una decisión informada en cuanto a su futuro reproductivo, y de realizar diagnós-tico prenatal, en caso lo requiriesen, en una eventual gestación.

ZUSAMMENFASSUNG

Die Verfassern haben ein Kind mit Lersch-Nyhan Sindrom untersucht. Es handelt sich um eim mutiertes Gen (HPRT). Die Verfassern hatten auch die Familie des Patienten untersucht und behaupten, dass die Mutter und einige Frauen in der Familie Heterozigoten wären, nicht aber die zwei Schwestern und die Tante mütterlicher Seite. Solche Information wurde für die genetische Beratung ­und prenatale Diagnose benutzt. Die Befunde seien die ersten in der Literatur.

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