Rev Med Exp.       Vol. 17 • Nº 1-4 • 2000

TEMA DE REVISIÓN

 

DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO DE LA LEISHMANIASIS TEGUMENTARIA AMERICANA

César Augusto Cuba Cuba*
* Departamento de Patología, Universidad de Brasilia, Brasil.

Resumen

La demostración directa o indirecta de Leishmania en las muestras patológicas continúa siendo un importante desafío en el diagnóstico parasitológico de esta protozoosis. A pesar de los avances significativos surgidos en investigaciones de biología molecular, muchas de sus técnicas con potencial aplicación diagnóstica, continúan siendo solamente herramientas de los laboratorios de investigación científica. Pocas de ellas se encuentran en fase de valorización clínica y epidemiológica en áreas endémicas, y quizás, de manera optimista, muy pocas estarían a disposición de los laboratorios de diagnóstico de salud pública en la próxima década. Mientras tanto, seguiremos contando con el auxilio de los llamados métodos clásicos de la Parasitología básica que todavía, en las manos de individuos experimentados, diagnostican la gran mayoría de los casos.

Este artículo identifica los métodos recomendados por los especialistas del tema, describe los procedimientos consagrados por su sensibilidad y reproductibilidad, concluyendo que éstos continuarán vigentes, siempre que sean correctamente ejecutados.

Palabras clave: Leishmaniasis cutánea/diagnóstico; Leishmaniasis mucotánea/diagnóstico; Parasitología/métodos (fuente: BIREME).

Abstract

Direct or indirect demonstration of Leishmania in pathological samples still constitutes a critical challenge when it comes to the parasitological diagnosis of this protozoose. In spite of significant and novel advances in the field of molecular biology of Leishmania, many of the techniques with a real potential diagnostic application, still continue to be the tools for laboratory scientific investigation. Few methods are in the stage of clinical and epidemiological application in endemic áreas. Being optimistic, very few techniques would be available at public health laboratories in the next decade in developing countries, where these parasites are prevalent. Meanwhile, we will have to continue to rely on the so called classical methods of Basic Protozoology, which under the supervision of experienced professionals will provide a diagnosis for the great majority of the cases.

This overview identifies the methods recommended by experts in this field, it also describes the procedures widely recognized by its sensitiveness and reproducibility, and it demonstrates that these methocis will continue to be used if they are appropriately performed.

Key words: Leishmaniasis cutaneous/diagnosis; Leishmaniasis mucotaneus/diagnosis; Parasitology/methods (source: BIREME).

Introducción

El género Leishmania comprende protozoarios parásitos pertenecientes a la Familia Trypanosomatídae y al Orden Kinetoplastida, cuya principal característica estructural es la de poseer un orgánulo citopiasmático: el kinetoplasto. La presencia de este último, es de capital importancia en la identificación morfológica de las fases evolutivas del género Leishmania.

El ciclo evolutivo, aparentemente simple, transcurre en dos huéspedes: un vertebrado (el hombre y otros mamíferos susceptibles), y un invertebrado (un insecto, la hembra hematófaga de un flebótomo del género Lutzomyia (Diptera, Psychodiidae). En el flebótomo, dos formas evolutivas se desarrollan en el tubo digestivo: una forma fiagelada, las promastigotes, con capacidad de multiplicarse asexualmente por división binaria longitudinal; y otra forma, que se diferencia morfológica y fisiológicamente para pre-adaptarse al parasitismo intracelular en el hospedero mamífero, éstas son las formas de promastigotas metacíclicas o formas infectantes 1. Cuando el insecto pica un vertebrado susceptible, las formas metacíclicas son inoculadas en la piel y dermis, y son fagocitadas por las células del Sistema Fagocitario Mononuclear (SFM). Las células invadidas permiten la transformación de las formas flageladas en formas amastigotes, en el interior de las vacuolas parasitóforas. Los amastigotes de Leíshmanía tienen la capacidad de evadir la acción parasiticida de las células del SFM y además, de multiplicarse por división binaria simple asexuada. Muchas de esas células liberan los amastigotes, en tanto que otras células, fagocitan los parásitos diseminando así el parasitismo en los tejidos, nódulos linfáticos y otras localizaciones tegumentarias. El resultado del proceso referido es la configuración de cuadros cutáneos y mucosos polifacéticos. Sumariamente, son vistas lesiones de tipo ulceroso, nodular, necrótico, vegetante, plaquetiforme, etc. Este polimorfismo clínico de las leishmaniasis cutáneas y mucosas influencian substancialmente los procedimientos empleados en el diagnóstico parasitológico.

Lamentablemente, cierto porcentaje de los individuos parasitados con algunas especies del sub-género Viannía (ver Tabla 1) desarrollan lesiones metastásicas con localizaciones subcutáneas linfonodulares, llamadas formas «esporotricoides» causadas por L.(V). guyanensís2, y localización en ganglios linfáticos 3.4 y mucosa del tracto respiratorio naso-buco-faríngeo­laringeos provocadas por L. braziliensis y, menos frecuentemente, por L. panamensis 6,7.

Un cuadro clínico caracterizado por una anergia selectiva en la inmunidad celular del individuo afectado, es la entidad nosológica conocida como Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD). En América, los infectados con L. amazonensís presentan un parasitismo extremamente agresivo e incurable: nódulos subcutáneos, y/o placas coalescentes, no ulceradas, que contienen un número impresionante de amastigotes y que, generalmente, res­petan las mucosas. En individuos inmunocompetentes, parasitados por L. (L) amazonensís, las lesiones son delimitadas, curables, pero interesantemente, presentan un porcentaje elevado de pacientes reactores negativos a la reacción de Montenegro8.

La preocupación de varios investigadores con relación a la etiopatogenia de las leishmanias es la comprobación de las vías probables de diseminación del parasitismo por Leishmania. La comprobación de la hipótesis de difusión hematógena y/o linfática ha producido resultados contradictorios. Los cultivos de la llamada «crema leucocitaria» de un paciente mucoso resultaron positi­vos según lo reportado por Bowdre 9, en tanto que, los aislamientos de Leishmania de linfonódulos vecinos a las lesiones, refuerzan la hipótesis de diseminación hematogénica y/o linfática 3. Nosotros fracasamos en los intentos de aislar L. (V) braziliensis en cultivos de monocitos circulantes, en pacientes cutáneos y mucocutáneos 10,11. Recientemente, Silveira no logró demostrar, en sangre periférica de pacientes parasitados por L. (L) Amazonensis, amastigotes circulantes usando hemocultivo 12 ; y últimamente, el asunto ha sido actualiza­do por Martínez quien refiere haber aislado L.(V) braziliensis de dos pacientes con lesiones mucosas: los parásitos fueron evidenciados por centrifugación diferencial de células mononucleares de sangre circulante 13. Todo esto no quiere decir que pensemos incluir como rutina diagnóstica, al hernocultivo, ya que consideramos este fenómeno un hecho esporádico y de difícil reproducibilidad.

Las leishmaniasis tegumentarias son diagnosticadas, en conclusión, cuando se demuestra la presencia de amastigotes en las lesiones sugestivas de este parasitismo. Igualmente, si por cultivo «in vitro», comprobamos la evolución de formas promastigotes derivadas de las respectivas formas intracelulares.

Es bien conocido que, las feishmaniasis tegumentarias son causadas por una variedad de diferentes miembros del género Leíshmania. Se sabe también que la patogenicidad, abordaje terapéutico y los posibles métodos de control de este complejo síndrome de enferme­dades son determinados, en gran parte, por la especie de Leishmanía. Es, por lo tanto, extremadamente impor­tante que en cualquier caso de leishmaniasis el agente etiológico sea identificado. En ese sentido, los científicos vienen desplegando considerables esfuerzos para con­seguir métodos que asocien diagnóstico e identificación en forma simultánea. La sonda ideal sería aquella de sensibilidad, especificidad y reproducibilidad total, apli­cada directamente en las muestras retiradas de las heri­das de los pacientes. Aparentemente los biólogos moleculares estarían próximos a proporcionarnos estas herramientas.

La Tabla 1 nos muestra las especies de Leishmania des­critas que parasitan al hombre, así como su distribución geográfica en América. La especie predominante en la gran mayoría de focos endémicos y brotes epidémicos 14 de Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA) es L. V braziliensís 15-17, lamentablemente, esta es la especie más difícil de diagnosticar y tratar.

Tabla 1. Agentes Etiológicos 8 especies de Leishmania) de Leishmaniasis tegumentaria Ameicana (LTA) y su distribución geográfica.

Parásitos* Tipo de enfermedad Distribución geográfica

A)Sub- género LEISHMANIA

Leishmania (Leishmania )mexicana Leishmaniasis cutánea (LC)"úlcera de los chicleros" México, Bellize
Leishmania (Leishmania )venezuelensis LC Venezuela
Leishmania (Leishmania) amazonensis Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD) Brasil, Ecuador, Venezuela, México, Perú, Bolivia, Guyana Francesa, republica Dominicana.

A)Sub- género VIANNIA

Leishmania (Viannia) braziliensis Leishmanisis cutánea (LC), mucosa y cutáneo-mucosa (LCM) "espundia" Brasil, paraguay, Perú, Bolivia, Colombia, Argentina, Ecuador, Venezuela, Nicaragua
Leishmania (Viannia) guyanensis LC "plan bois", LCM (poco frecuente)ø Guyana Francesa, Brasil ø, Perú, Colombia
Leishmania (Viannia)panamensis LC, LCM (poco frecuente)ø Panamá, Colombiia, Ecuador, Nicaragua, Costa rica
Leishmania (Viannia)colombiensis LC Colombia
Leishmania (Viannia)peruaviana LC " Uta" Perú
Leishmania (Viannia)naiffii LC Brasil
Leishmania (Viannia)lainsoni LC Brasil
Leishmania (Viannia)shawii LC Brasil

* Laison 18
   øAlgunas veces causando compromiso mucoso.

Métodos y técnicas de diagnóstico parasitológico de  LTA

Debemos siempre tener en cuenta que los procedi­mientos empleados en el diagnóstico de LTA depende­rán, en gran parte, de la finalidad e infraestructura del laboratorio en que actuemos. Si se trata de un laboratorio de investigación, que apoya logísticamente estudios epidemiológicos en áreas endémicas, la metodología será más compleja; sin embargo, si se trata de un labo­ratorio hospitalario o de una posta médica de salud, es­cogeremos las técnicas que por su simplicidad, costo y reproducibilidad sean las más efectivas y sensibles.

Por otro lado, sabemos que, debido al polimorfismo clí­nico de la LTA, los métodos de demostración y aislamiento de los parásitos variarán en la obtención de las mues­tras.

La Tabla 2 presenta una revisión parcial de la literatura recientemente publicada, y en el que pretendemos mos­trar la interdependencia que existe entre el tipo de proce­dimiento utilizado en la colecta de las muestras clínicas y la sensibilidad del diagnóstico parasitológico.

Dos alternativas surgen en el diagnóstico parasitológico. La primera será demostrar que el paciente está alber­gando Leishmania: lo haremos visualizando los amastigotes en los tejidos infectados. La segunda opción, será intentar aislar directamente de las lesiones sospechosas, en cultivos «in vitro» los promastigotes. Ambas son las más recomendadas, aunque en la prác­tica, en los servicios de salud pública solamente los frotices de material de las lesiones son ejecutados. Sin embargo, ambos procedimientos son aplicados de ruti­na en los estudios epidemiológicos, en muchos focos endémicos de América.

En la siguiente secuencia de este artículo discutire­mos algunas dificultades encontradas en la investiga­ción de Leishmania en pacientes. Se formularán reco­mendaciones y se señalarán pequeños detalles para re­forzar la habilidad de diagnosticar los parásitos.

Colección de muestras patológicas

1. INVESTIGACIÓN DE AMASTIGOTES

1. 1. De lesiones cutáneas:

La úlcera es la más frecuente presentación clínica de LTA. Independientemente de la especie de Leishmania causante del cuadro dermatológico, estas lesiones ulcerosas francas generalmente se encuentran conta­minadas secundariamente con diversos patógenos. Pue­den estar presentes hongos como Paracoccidiodes braziliensís, y Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii y bacterias piogénicas, tipo Staphylococcus y Streptococcus, o también Mycobacterium.

Es práctica universal proceder a ejecutar una buena ta­rea aséptica previa, a la toma de la muestra. Se usan líquidos antisépticos como agua oxigenada (10 volúme­nes), Furacin (0,22 mg/ml), alcohol al 95% o alcohol al 70%. La finalidad es remover el material costroso, teji­dos necrotizados, pus y otros detritos de las lesiones. Incluso, algunos han realizado estudios comparativos entre el uso de la solución iodada con una solución de agua y jabón en la optimización de la asepsia de las heridas, previas al cultivo de Leishmania, concluyendo que no existía diferencias en la utilización de uno u otro elemento en cuanto a su potencial interferencia en la via­bilidad del parásito.

Esta primera etapa del trabajo diagnóstico es importante y ha recibido la atención de muchos investigadores, quie­nes, dependiendo del método de recolección utilizado, han encontrado una eficiencia en sus resultados que varía entre 18,0% y 52,0%. El porcentaje encontrado por Navin19 en 65 lesiones de pacientes infectados, supues­tamente, por L. (V) braziliensis y/o L. (L) mexicana, es sorprendentemente elevado con relación a otras observa­ciones y a las nuestras. Pensamos que los autores diag­nosticaron pacientes infectados predominantemente por L. (L) mexicana, sub-género caracterizado por su eleva­da densidad parasitaria.

Tabla 2.  Sensibilidad de los procedimientos utilizados en la demostración directa por frotices de amastigotes en LTA (lesiones cutáneas)

Investigador/País

Procedimientos Instrumnetos No. (de lesiones/ pacientes) Sensibilidad Diagnostica
 

Navin 19
Cuatemala

Biopsa Bisturí (N(10-15) 65 lesiones Nro de positivos % de Positividad
34 52,0
Raspado- escobilla Dental broach N° 6) 65 lesiones 32 49,0
Aspirado con tubos capilares (hematocriotos) 65 lesiones 34 52,0
Weigle 20
Colombia
Biopsa- bisturí (N° 10-15) 101 pacientes (parasitos +) 33 32,7
Biopsa "punch" 4 mm 96 pacientes (Montenegro+) 20 20,8
Urjel21 Raspado-Escobilla (Dental broach N° 6) 32 pacientes 01 3,1
Raspado. palito de fósforos (Matchstick) 32 pacientes 06 18,7
Cuba Cuba Biopsa "punch" 4mm 120 pacientes ( Montenegro+) 21 18,0
Raspado- palito de fósforos (Matchstick) 92 pacientes ( parasitos+) 30 32,6

 

Cuando, por el contrario, los parásitos circulantes en áreas endémicas pertenecen al sub-género Viannia, la eficiencia de visualización y aislamiento de Leishmanía es menor. Los resultados por frotices se sitúan en un índice de alrededor de 30,0% - 40,0% de los pacientes infectados.

Los datos de la literatura que mejor se comparan son los de Brasil y Colombia, esto debido al empleo de protoco­los similares de diagnóstico parasitológico. En Brasil, desde el inicío de nuestros estudios, observamos que visualizar amastigotes de Leishmania en nuestros pacientes era tarea difícil. Esa dificultad, está relacionada con la biología del parasitismo que cada especie exhibe en el hospedero humano: en 1981, diagnosticamos en los frotices directos de las lesiones 25,0% de resultados positivos, quince años después, esta figura mejoró a 44,0%.

Sobre el aporte de la histopatología, siempre fue y conti­núa siendo difícil para un patólogo visualizar amastigotes de Leishmania en los cortes de tejido rutinariamente co­loreados por hematoxilina-eosina (H&E). Nosotros afir­mamos esto porque frecuentemente observamos que fragmentos de las mismas biopsias presentaban pará­sitos en los frotices coloreados por Giemsa. En nuestra casuística inicial, nuestro patólogo describió un 27,0% de histología positiva, similar a otras series de 28,0% 22 y muy parecidas a las de Weigle (21 0%)23, Navin (18,0%)19 y Dimier-David (26,6%)24.

Es digno de mencionar el comentario de Ridley25, que dice que la mayoría de patólogos están de acuerdo que un diagnóstico histológico confiable de leishmaniasis es imposible sin la identificación del parásito. En este con­texto, una alternativa sería el empleo de la técnica de Giemsa-colophonium26, empleada en la coloración de los parásitos tisulares de malaria. En nuestra experien­cia, limitada a observaciones de leishmaniasis experi­mental en harnsters, los amastigotes de L.(V) braziliensis son bien evidenciados, especialmente por una nitidez mayor del kinetoplasto que se colorea de rojo intenso en los cortes clarificados por el colophonium. De acuerdo a nuestro conocimiento, esta técnica no ha sido evaluada en muestras humanas clínicas de LTA.

Un avance importante en este campo ha sido la introduc­ción de técnicas inmunocitoquímicas. Sells27 utilizó con éxito relativo la técnica de inmunoperoxidasa indirecta (IMPI) con un antisuero policional de conejo para marcar amastigotes en dos pacientes con leishmaniasis. La IMPI fue también evaluada en 265 biopsias de lesiones tegumentarias causadas por L. (V) braziliensis y L. (V) panamensís en Colombia; en este último estudio, la observación y localización de los parásitos fue más efi­ciente usando el método de IMPI (61,0% de positividad, en 181 pacientes) que lo obtenido con la histopatología convencional con H&E (34,8%), la eficiencia del método de IMPI fue mayor en lesiones precoces (75% de los ca­sos con menos de 3 meses de evolución), 37,5% (6 meses) y 21% en los de 12 meses a más. Asimismo, el uso combinado del examen directo e IMPI permitió un diagnóstico etiológico de 72.0%28.

De otro lado, Lynch 29 y Anthony30 usaron anticuerpos monocionales en la detección de amastigotes de lesio­nes cutáneas.

1.2 De lesiones Mucosas:

En relación con las formas mucosas únicas o múlti­ples, los procedimientos generalmente utilizados para el diagnóstico de amastigotes son:

- La biopsia obtenida con la ayuda de pinzas cortantes especiales (Cutting biopsy punch), después de la in­filtración con un anestésico local (xylocaina al 10%, por ejemplo). Se retira un número variable de frag­mentos de tejido en la dependencia de la extensión del granuloma y de su accesibilidad.

- Los frotices de las biopsias que, fijados con alcohol metílico o mejor, con líquido de Bouin, son colorea­dos por el método de Giemsa.

- Biopsias para estudios histopatológicos, fijadas con Formo-Zenker (neutro) al 10%, y cortes de Slim colo­readas por H&E.

Los datos parasitológicos cuantitativos de la infección mucosa son extremamente escasos. Muy pocas son las publicaciones que localizan la eficacia y sensibilidad de los procedimientos empleados. Generalmente el análi­sis del parasitismo se realiza en las formas cutáneomucosas. Todos sabemos que L. (V) braziliensis es difícil de diag­nosticar en los granulomas mucosos31.

En 1981, nosotros informamos que de 27 pacientes, 5 (19,9%) fueron amastigotes positivos en los frotices de biopsias. En otra serie de pacientes, en 1984, publica­mos los siguientes resultados para nuestros 51 pacien­tes evaluados: 27,4% de positividad en los frotices de las biopsias y 16,0% para los hallazgos histopatológicos. Estos resultados son opuestos a los de Dimier-David 24 que publicaron una positividad de 17,7% en 112 frotices de individuos con lesiones mucosas. Ellos describieron también que, en su casuística de 116 pacientes mucosos, la histopatología fue positiva en 28,4% constituyéndose ésta última, en su opinión, en la técnica más eficiente para la demostración parasitológica de L. (V) braziliensis.

Marsden 32 llama la atención que es más fácil detectar los parásitos en lesiones mucosas múltiples, que en lesio­nes únicas de L. (V) braziliensis,- Dimier-David 24, en Bolivia, trabajando con infecciones causadas por L. (V)braziliensis en pacientes con lesiones mucosas múltiples y únicas, encontró similar información: 57,7% y 42,2% de positividad, respectivamente.

2. INVESTIGACIONES DE PROMASTIGOTES

De las fases evolutivas de Leishmania, la forma promastigote es la más fácil de ser cultivada «in vitro», en ella se hacen la mayoría de las investigaciones parasitológicas. Enfatizando los aspectos médicos y epidemiológicos, los principales objetivos del cultivo de Leishmania son:

- El diagnóstico de la infección por los laboratorios de Salud Pública y de hospitales.

- El aislamiento primario del parásito del hombre, flebótomos y otros reservorios mamíferos, en los estudios epidemiológicos.

- La preparación de «stocks» de Leishmanía, para estudios bioquímicos e inmunológicos de identifi­cación, o la elaboración de antígenos convenciona­les no purificados.

- El clonaje de «stocks» y cepas representativas para tests «in vitro» de susceptibilidad o resistencia a los quimioterapéuticos.

No es nuestra intención revisar la extensa literatura pu­blicada por diversos investigadores en relación al cultivo «in vitro» de Leishmania. Los lectores interesados pue­den remitirse a las revisiones del tema hechas por Hendricks33, Jaffe34, y Evans35. Se dará énfasis a los procedimientos y medios que, en nuestro concepto, han con­tribuido al mejor diagnóstico de LTA. Muchos de esos métodos han sido empleados por nuestro grupo a lo lar­go de los últimos 18 años de investigaciones en L. (V) braziliensis.

Ya en la década del 70, era opinión generalizada que los parásitos pertenecientes al hoy, sub-género Viannía (braziliensis complex), eran difíciles de cultivar. Este he­cho era completamente opuesto a la facilidad con que se cultivaban las leishmanias del sub-género Leishmania (mexicana complex) en cualquier medio de agar sangre. Hoy sabemos que no existe un único medio de cultivo artificial capaz de reunir características tales que consiga cumplir los objetivos enunciados. Lo ideal sería un me­dio universal que sea sensible, líquido, liofilizable, que mantenga un tiempo de validez para su uso relativamen­te largo y, finalmente, sea protegido por antibióticos y antimicóticos36. Podemos afirmar que, continuamos aguardando la formulación de tal medio ideal, el que se­ría una gran contribución para los laboratorios de las áreas endémicas.

Diversos autores 37-39 han abordado el tema empleando diversos medios líquidos, normalmente utilizados en el cultivo de células de insectos, y también de células de mamíferos, en Leishmania del Nuevo y Viejo Mundo. Sin embargo, la regla básica es que se requieren diferentes medios de cultivo para cumplir diferentes finalidades, es decir, no existe un medio universal que sirva para aislar, multiplicar el parásito y mantenerlo por largo tiempo en subinóculos sucesivos y para obtener gran masa de células. Si bien existen medios que sirven para el transporte y mantenimiento prolongado de los parásitos ya adapta­dos artificialmente, ellos no son tan eficientes para propi­ciar la transformación de amastigotes en promastigotes, paso indispensable para un eficiente aislamiento prima­rio del parásito en los pacientes de leishmaniasis. Además, el crecimiento de las diversas especies de Leishmania y de los diversos «stocks» aislados en pun­tos geográficos distintos es variable, por lo que se nece­sita del uso de varios tipos de medios.

Por lo tanto, es recomendable que cada área endémica de LTA ensaye primero algunos medios conocidos por su sensibilidad. Esto permitirá una mayor eficiencia futu­ra en el aislamiento de los parásitos que circulan en el foco de transmisión.

3. Medios de Cultivo

3.1 Monofásicos (líquidos)

En el cultivo de Leishmania se han empleado me­dios de cultivo de células de mamíferos, suplementados con porcentajes variables de Suero Bovino Fetal (SBF). Algunos ejemplos de ellos, reportados en la literatura con eficacia variable, son: el medio de Eagle, el medio MEM (Mínimal Essential Medium, 20%, SBF), el medio 199 TC, y el Medio RPMI 1640. Estos medios son de difícil aplicación y uso en las áreas endémicas de los países pobres, ya que el costo y la necesidad de importa­ción dificultan su aprovechamiento.

También se utilizan medios líquidos empleados en el cultivo de células de insectos, como por ejemplo el me­dio de Schneider (muy empleado en el cultivo de células de Drosophila y que ha tenido mayor difusión en nues­tros países), el medio Grace y el medio de Mitsuhashi­Maramosch, estos dos últimos utilizados en aspectos biológicos moleculares de Leishmanial. Es oportuno co­mentar que la concentración del SBF empleada, reviste mucha importancia en el éxito del cultivo de Leishmania: todos los medios líquidos citados emplean concentra­ciones variables de SBF que fluctúan entre 10,0% y 20,0%.

3.2 Medios Bifásicos

Diversos autores han publicado listas detalladas de medios de cultivo sólidos, semisólidos y bifásicos em­pleados en el cultivo de los promastigotes y la cinética de crecimiento de Leishmania 33,35. Citaremos únicamente los más utilizados por los investigadores latinoamericanos:

- Medio Bifásico de Agar Sangre, NNN, 3N (Medio de Novy, McNeal, Nicolle)40: constituye el más antiguo y conocido medio empleado para el cultivo de parási­tos hemáticos y tisulares.

- Medio de Agar Sangre USAMR U38: medio de compo­sición simple, preparado con un agar base enrique­cido, consagrado por la mayoría de los investigado­res, en América.

- Medio de Senekjie: enriquecido con Bacto-peptona y Bacto-beef, ha sido constantemente utilizado en Panamá y Colombia con éxito en el diagnóstico de LTA.

Entre algunas de las ventajas prácticas de la adopción de medios bifásicos de agar sangre para el diagnóstico primario se mencionan las siguientes:

- Son particularmente valiosos para el aislamiento pri­mario y el mantenimiento, por largo tiempo, de los «stocks» de Leíshmania.

- Permiten la morfogénesis celular de amastigotes en promastigotes, en la gran mayoría de los aislados de L. (V) brazilíensis, y de otras especies del sub-géne­ro Viannia, así como del sub-género Leishmania.

- Son apropiados para los estudios de curvas de creci­miento, lográndose densidades de 107-108 promastigotes por mL- de cultivo «in vítro». El medio permite también el establecimiento de la fase esta­cionaria de crecimiento, en aproximadamente 6-7 días (ver Figura 2), característica importante para la mayor eficiencia de la infectividad de las cepas de Leishmania.

- Son de fácil preparación y de bajo costo, sobre todo en nuestro medio.

Entretanto, existen también algunos inconvenientes en­tre los cuales podríamos citar:

- La dificultad de poder estandarizarse, por ser químicamente complejos y no definidos.

- No son apropiados para el crecimiento en masa de los flagelados por la presencia del agar, por lo que es necesario utilizar mejor los medios líquidos para la preparación de antígenos convencionales y células para estudios bioquímicos.

Un medio bastante empleado y de eficiencia comproba­da en el aislamiento primario y conservación de «stocks» es el agar sangre USAMRU (agar enriquecido de la DIFCO). Diversos autores lo emplean validando su bue­na actuación y sensibilidad 10.42-4-5 y nosotros lo adopta­mos como medio de rutina para el diagnóstico de LTA. Nuestro laboratorio en Brasilia, ha cultivado en los últi­mos años más de 500 aislados de L. (V) braziliensis, y este medio ha servido para formar el Banco de Criopreservación de la Unidad de leishmaniasis con ce­pas criopreservadas por más de 18 años que sirven para realizar modernos estudios de genética y de biología molecular en L. (V) braziliensis. Un ejemplo de ello es la MHOM/BR/83/LTB-300, cepa de referencia internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS), producto del criobanco de Brasilia 46.

Sin embargo, algunos autores prefieren el medio bifásico de Senekjie modificado por la adición de medio líquido RPMI-1640 y con 30,0% de sangre desfibrinada de conejo 47-48 . El aislamiento primario de L. (V) guyanensis ha sido logrado exitosamente en éste medio por Santrich6.

4. MÉTODOS DE CULTIVO

4.1 Aislamiento primario de las lesiones cutáneas

Constituye el paso más importante del proceso diag­nóstico, ya que de este procedimiento dependerá el futu­ro establecimiento del parásito y su crecimiento «in vitro».

La sensibilidad del método está directamente relaciona­da con la correcta selección que hagamos del medio más apropiado. Asimismo, la habilidad del investigador para escoger el local de la lesión que sea la de mayor actividad parasitaria, solo surge después de varios años de experiencia y práctica.

En el contexto anterior, se aconseja un estudio piloto empleando algunos medios conocidos. Este estudio servirá de marco referencial para saber con que parási­tos estamos trabajando en la región. Este abordaje establecerá, en corto período de tiempo, el medio apropiado para el aislamiento primario. Posteriormente, si estamos interesados en estudios más profundos de la biología o epidemiología de las leishmanias, usaremos otros me­dios existentes en la literatura18.

Para la realización de los cultivos, nosotros preferimos la técnica de aspiración de las lesiones, por el procedimien­to descrito inicialmente por Hendricks38, ligeramente mo­dificado. Preferimos utilizar una jeringa más potente, de 5mL, y una aguja de mayor calibre, 22G. El vehículo será 0,2- 0,3 mL de suero fisiológico estéril (Figura 1).

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Figura 1. Aislamiento primario de Leishmania a partir de lesiones cutáneas.

Previamente, y conforme ya fue discutido, es crucial un riguroso proceso de asepsia y limpieza de las lesiones. Esto va íntimamente relacionado con los problemas de contaminación por otros microorganimos 45,49. La super­ficie del área a ser trabajada es limpiada, de manera sistemática y en

forma secuencial, con: agua oxigenada, agua estéril con detergente, alcohol iodado, alcohol al 95%, y finalmente agua estéril. Este ritual ayudará a dis­minuir significativamente la contaminación bacteriana y fúngica. La muestra también puede ser obtenida a través de una biopsia («punch»), y posteriormente triturada con la ayuda de un «tissues grinder», en una solución de suero fisiológico y antibióticos (Garamicina, 200 mg/mL; S-Fluorocytosine, 250 mg/mL). Algunas gotas de este homogenizado serán inoculadas en los tubos de cultivo. Es importante señalar que la excesiva presencia de san­gre en las muestras colectadas es perjudicial para el desarrollo del parásito. Según Evans35, la sangre contiene proteínas séricas; altamente inhibitorias para el crecimiento de los promastigotes de Leishmania.

4.2 Aislamiento primario de las lesiones mucosas

Es bastante difícil aislar Leishmania de los granulomas mucosos, en medios de cultivo. La razón principal es la elevada contaminación de los tubos de cultivo, ya que tanto bacterias como hongos ambientales y del huésped crecen rápidamente en los medios eliminando la posibi­lidad del crecimiento del parásito. Nosotros hemos em­pleado algunos procedimientos para aliviar el problema, como el descrito por Herrer50. De manera similar, incuba­mos fragmentos de las biopsias de los tejidos mucosos en altas concentraciones de antifúngicos (5-Fluorocytosine) y antibióticos (Gentamicina y Estreptomicina), a 4°C, du­rante 24 horas. Esto lo realizamos previamente a la ino­culación de los tubos de cultivo. Sin embargo la eficacia es poco significativa.

Nuestro mejor hallazgo ha sido de 30,0% de positividad en pacientes mucosos en área endémica de L. (V) braziliensis22: Dimier-David 24 en 94 pacientes bolivianos con lesiones mucosas consiguió 23,0% de positividad diagnóstica en medio NNN complementado con Schneider y antibióticos, como fase líquida. Los parási­tos aislados fueron identificados por Revollo como L. (V) braziliensis51.

Demostración del paarsitismo por Leishmania mediante la inoculación de animales  de laboratorio

1 . EN RATONES ISOGÉNICOS Y NO ISOGÉNICOS

La utilización de animales de laboratorio en infeccio­nes experimentales por diversas especies de Leishmania ha permitido el establecimiento de algunos modelos en leishmaniasis. Estudios de nuevos agentes terapéuticos 52-54, investigaciones sobre los mecanismos que go­biernan la patogenicidad del parásito, tanto humoral como celular durante el curso de la infección experimental han sido descritos en la literatura 55-58. El curso de la infección en los ratones y, probablemente, en otros animales de laboratorio, es considerablemente influenciado tanto por la especie del parásito, como por los factores genéticos del hospedero.

Diferentes cepas de ratones isogénicos varían en su com­portamiento frente a la infección por L. (L) tropica, L. (L) mexicana, L. (V) braziliensis L. (V), panamensis, etc. La innata susceptibilidad o resistencia al parásito es genéticamente controlada59.

El conjunto de todas esas observaciones ha llevado a la conclusión que, existen disponibles importantes mode­los murinos experimentales que reproducen parcialmente la biología del parasitismo por Leishmania. Lamentable­mente, la utilidad diagnóstica de esos modelos es limi­tada sólo para la gran mayoría de las especies del sub­género Leishmania. Muy pocas son las especies del sub­género Viannia que han sido adaptadas a alguna cepa de ratón «in bred». Hasta el presente no tenemos, toda­vía, un animal experimental de laboratorio que reproduz­ca la enfermedad mucosa provocada por L. (V) braziliensis. Estrictamente, hablando de diagnóstico parasitológico, sólo contamos con el concurso valioso del hamster dorado, Mesocriectus auratus.

Para ilustración de nuestros lectores, a continuación ci­taremos algunas líneas de ratones isogénicos más co­múnmente utilizados por los investigadores con cepas de Leishmania del Nuevo Mundo (Tabla 3).                                                            

Tabla 3. Líneas de ratones isogénicos más comunmente utilizadas con cepas de Leishmania del mundo.                       

LÍNA DE RATÓN SUSCEPTIBILIDAD AUTORES
-C57 Bl/6 Suceptible a L. (L) mexicana Perez 58, Moriearty 60
-BALB/C Suceptible a L. (L) mexicana Trotter 52
-BALB/C Suceptible a L. (L) panamensis Childs 61
-BALB/C Resistente a L. (L)braziliensis Cuba Cuba 44
-DBA/1 Suceptible a L. (L) mexicana Trotter 52
-DBA/2 Resistente a L. (L) braziliensis Cuba Cuba 44
-C3H Suceptible a L. (L) mexicana Grimaldi 62
-A/J Resistente a L. (L)braziliensis Cuba Cuba 44
-A/J Suceptible a L. (L) panamensis childs 61

 

Otro roedor utilizado para estudios por su potencial como modelo experimental con L. (V) panamensis es Mystromys albicaudatus. En él, las lesiones nodulares son de lenta evolución (se tornan visibles a los 9-12 meses pos-ino­culación), y desaparecen posteriormente espontánea­mente, demostrando su poca sensibilidad a Leishmania; lógicamente, no es útil en el diagnóstico.

2. EN HAMSTERS DORADOS Mesocriectus auratus

Fue Adler quien relató que la primera vez que éstos cricétidos fueron empleados en la investigación de leishmaniasis ocurrió en el Mediterráneo (en la investi­gación de Kala-azar). Eso fue en 1930, por el equipo del Departamento de Parasitología de la Universidad Hebrea de Jerusalem. Después, este roedor fue distribuido por el citado autor a diversos centros de investigación de Europa y América; aunque Rey63 ya estudiaba, en Esta­dos Unidos, una cepa que él llamó L. (V) braziliensis inoculada en harristers.

Sin embargo, se atribuye a los investigadores ingleses64, el mérito de introducir el uso del harnster como parámetro esencial de la caracterización biológica de las leishmaniasis del Nuevo Mundo. Por lo que, considera­mos que la crianza de los cricétidos es condición indis­pensable en todo laboratorio de investigación en leishmaniasis.

El procedimiento más adecuado para el aislamiento pri­mario de Leishmania utilizando los hamsters es por medio de las biopsias practicadas en las lesiones de los pa­cientes sospechosos de leishmaniasis. Estas son obte­nidas con la ayuda del «punch» de 4mm de diámetro o de una navaja de bisturí. Las biopsias son entonces tritu­radas utilizándose un «tissues grinder plain» de 15 mL y suero fisiológico estéril. La suspensión de los tejidos es luego inoculada intradérmicamente (0,1 mL) en la base de la nariz (dorso), patas posteriores (dorso) o ambos lugares del hamster (Figura 2), aunque también se acos­tumbra inocular intraperitonealmente, pues muchos de estos parásitos tienden a visceralizar. Normalmente, se inyectan dos animales por paciente, los animales pasan a ser examinados semanalmente, y permanecen en una sala de mantenimiento a temperatura adecuada (25°C). A la primera señal clínica de infección, se procede al tra­bajo de aislamiento y comprobación parasitológica.

Los siguientes datos deben ser sistemáticamente ano­tados:

- Período de incubación aproximado en el aislamien­to primario del parásito.

- Período de incubación aproximado en las inoculaciones subsecuentes (hamster-hamster).

- Características evolutivas de las lesiones (tamaño, ulceración, necrosis de patas, etc.).

- Densidad parasitaria relativa en el local de inoculación.

- Metástasis: tiempo aproximado - locales observa­dos.

- Visceralización: tiempo aproximado, órganos com­prometidos, densidad parasitaria relativa.

Las cepas de L. (V) panamensis, L. (V) guyanensis y al­gunas L. (V) brazilíensis visceralizan, colonizando princi­palmente ganglios regionales, bazo e hígado del harristers 51,65,66. Este comportamiento de la L. (V) braziliensis ha sido también documentado en cepas aisladas en los focos endémicos de LTA, de Santiago del Estero y Salta, Argentina 67. Curiosamente, esto no se registra con las cepas colombianas de L. (V) braziliensis66, y tampoco en los parásitos aislados en Pará (Lainson, comunicación personal). De manera muy esporádica, es posible ob­servar un foco metastásico cutáneo con L. (V) braziliensis68, ya que esta especie puede visceralizar y luego producir lesiones metastásicas cutáneas, cuando inyectamos formas metacíclicas del parásito69.

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Figura 2. Hamster inoculados con parásitos de leishmania. Se observan lesiones ulceradas en la base de la nariz y dorso de las patas.

Concordamos con las observaciones de otros autores que afirman que la técnica de inoculación del hamster con el triturado de las biopsias de las lesiones, la mejor y más eficiente manera de aislar Leishmania. Esto último es especialmente cierto tratándose de lesiones de «espundia», la forma más grave y mutilante del parasi­tismo por L. (v) braziliensis22,23,70 .

Con relación a la ruta y lugar de inoculación existen dis­crepancias pero, es la base de la nariz y el dorso de las patas inyectadas con las formas amastigotes y promastigotes, intradérmicamente, las más usadas71.

3. EL USO DE LA INOCULACIÓN DE HAMSTERS EN EL DIAGNÓSTICO DE LTA

Nuestra eficiencia con este método es de 60% de éxito en la positividad de los animales inoculados con la suspensión de la biopsia triturada y, de solo aproximada­mente 35%, cuando procedemos a aspirar, con aguja y jeringa las lesiones e inmediatamente inoculamos los animales. Ambos procesos son complementarios al pro­ceso de aislamiento de Leishmania. Para comprobar el parasitismo del hamster inoculado no basta hacer un simple frotis del lugar clínicamente positivo, es necesa­rio cultivar; ello porque el frotis apenas demostrará 25% de animales con amastigotes.

El cultivo efectuado hasta las primeras 3 semanas de inyectado el animal será significativamente más eficien­te72. Esto debe ser hecho toda vez que los lugares inyec­tados no presenten evidencia de infección. Por otro lado, sabemos que existe un espectro de infección cuando trabajamos con las cepas de Leishmania en el hamster: ciertos aislados primarios solo infectan el lugar de ino­culación pero no producen señal de inflamación eviden­te, esto ocurre en la presencia de amastigotes compro­bados por cultivo; otros producen lesiones nodulares que rápidamente crecen y ulceran; y por último, algunos aisla­dos provocan lesiones evidentes y, concomitantemente compromiso visceral. Se debe pues prestar atención a todas estas posibilidades y evitar perder cepas que impi­dan hacer el diagnóstico.

A pesar que el empleo de este método de diagnóstico «in vivo» es lento con relación al cultivo directo y a la impronta, la ventaja práctica esencial es que el animal «limpia» de contaminantes bacterianos y fúngicos las muestras patológicas. Esto es importante en las biopsias obtenidas de las heridas mucosas.

Con relación a L. (V) braziliensis, Llanos-Cuentas 73 tra­bajando con 71 pacientes cutáneos observó que el mé­todo con mejor rendimiento para diagnosticar Leishmanía fue la inoculación en el hamster (69,9% de positividad), seguidamente de la histología (48,0%), el cultivo «in vitro» (33,0%), y el frotis coloreado por Giemsa (31,5%). Lógi­camente, la demostración del parásito aumentó con el empleo de un mayor número de métodos, así, solamen­te frotices obtuvo 31,0% de positividad, adicionando la histología 58,0%, y más la inoculación en hamster se alcanzó 80,0% de positividad acumulada. Esto constitu­ye el mejor rendimiento en el diagnóstico de LTA forma cutánea. En contraste, en 55 pacientes mucosos los pa­rásitos fueron demostrados sólo en 48,0%, llamando la atención que, en pacientes con lesiones mucosas múltiples, el parasitismo fue comprobado en 72,7%.

Comentarios Finales

El diagnóstico parasitológico de LTA es parte funda­mental del estudio de la enfermedad. Es condición obli­gatoria cuando se desea probar la acción de un nuevo medicamento y difundir el esquema terapéutico de un paciente parasitado, entre otras utilidades clínico­epidemiológicas. Pensamos que muchas de las infec­ciones causadas por las diversas especies de Leishmania son difíciles de diagnosticar. Sin embargo, es el parasitismo por L. (V) braziliensis el que presenta el mayor desafío al profesional de salud. Marsden revisa, más de una vez el asunto, y enfatiza la dificultad encon­trada por un clínico para demostrar el parasitismo por L. (V) braziliensis en 3 pacientes con lesiones mucosas cró­nicas y mutilantes.

De los métodos diagnósticos descritos, dos son los que merecen ser destacados por su eficiencia y sensibilidad: el cultivo «in vitro» y la inoculación en hamsters. Entre­tanto, en los estudios de investigación parasitológica hecha por diversos autores, comprobamos una gran variación en la sensibilidad, pues los índices fluctúan entre 19,0% y 83,0%. Esto sería explicado por diferencias en la metodología empleada, tiempo de la enfermedad y la forma clínica de los pacientes estudiados.

En leishmaniasis, tanto cutánea como mucosa, el éxito en el aislamiento es inversamente proporcional al tiem­po de duración de la enfermedad. Además que el trata­miento específico previo disminuye la eficiencia de demostración del parásito. Sin embargo, nosotros obser­vamos que existe un parasitismo residual en individuos que han completado series regulares de Glucantime, siendo posible pues aislar parásitos viables en espacio de tiempo relativamente corto, después del tratamiento.

Debemos admitir que no existe una técnica de aislamiento que reúna todas las características necesarias a fin de diagnosticar parasitológicamente 100% de los pacien­tes con LTA, siendo de opinión generalizada, que el máxi­mo rendimiento se consigue con la combinación de 2 ó 3 de ellas. Si a esto se asocian, la prueba de Montenegro y la serología por ELISA, el diagnóstico laboratorial de LTA puede llegar a más de 90,0%.

Cuando queremos no sólo diagnosticar, sino también aislar el parásito del paciente, los métodos de cultivo son muy eficientes, si se trabajan con los cuidados sugeri­dos en esta revisión. No existe a disposición de los estudiosos de leishmaniasis un único medio de cultivo «in vitro» que tenga aplicación universal y soporte el creci­miento de todas las especies de Leishmania humanas. Esto implica la necesidad de estudios previos de evalua­ción que informen cual es el más apropiado para las 6 especies de parásitos que circulan en la región endémica.

Tratándose de infecciones causadas por L. (V) braziliensís, el esfuerzo siempre tenderá a encontrar un método ideal, rápido, sencillo y barato para la diferenciación del agente etiológico de esta entidad, con el resto de infecciones causadas por otras leishmanias menos patogénicas y de mejor pronóstico. Un diagnóstico precoz es pues obli­gatorio en la leishmaniasis mucosa de fase inicial, para quizá prevenir el compromiso más grave: el síndrome de «espundia».

Como resultado de lo descrito anteriormente, reciente­mente ha surgido una estrecha colaboración entre los laboratorios de investigación de campo en leishmaniasis y los puestos de salud de áreas endémicas. Nuevas herramientas diagnósticas han surgido de la investigación efectuada en biología y genética moleculares. Se han identificado antígenos con potencial diagnóstico, producto del clonaje de genes que los codifican y, como resultado de la tecnología de ADN recombinante, han surgido proteínas. Todo esto nos lleva a creer en un futuro mejor en el campo del diagnóstico de LTA 14.

Actualmente las técnicas de hibridización de los ácidos nucleicos permiten establecer relaciones nucleotídicas entre las leishmanias. Él ADN-K de Leishmania tiene ca­racterísticas singulares que han permitido desarrollar métodos basados en la detección de secuencias de nucleátidos del ADN-K pertenecientes a un organismo desconocido que resultan ser complementarios a las secuencias de una cepa de referencia internacional. Esto ha llevado a la descripción de un número considerable de sondas altamente sensibles en el diagnóstico de LTA. En el inicio de la década de 1980 estas sondas emplea­ban material radioactivo, eran sondas isotópicas, y los parásitos detectados provenían de cultivos y de anima­les experimentales, y la detección era por una hibridización «in situ»74,75; sin embargo, las sondas radioactivas de ADN-K no proporcionaron adecuada sensibilidad diagnóstica y fueron poco populares entre los investiga­dores de los países endémicos por razones obvias.

Posteriormente, De Bruijn 76 presentó resultados muy promisorios cuando asoció la técnica del PCR (Polymerase Chain Reaction) a una hibridización «in sítu» realizada en láminas de pacientes de Colombia, Vene­zuela y Perú, y que llevaron al autor a declarar que la sonda desarrollada era Leishmania complex específica y serviría para el diagnóstico de LTA. A su vez, Lópes77 publicó sus estudios realizados en Perú con pacientes cutáneos y mucosos aplicando PCR directamente en material de biopsia. A fin de validar clínicamente la sonda desarrollada en laboratorio, se tomaron muestras de pacientes de ambientes rurales, las cuales fueron com­parativamente estudiadas mediante PCR-hibridización con los métodos clásicos de frotices y cultivos «in vitro». Los autores relataron una sensibilidad significativamente mayor en el método de amplificación e hibridizacion del ADN en el diagnóstico de campo.

Concluimos diciendo que todo este potencia¡ para el diagnóstico de LTA que surge del campo de la biología molecular requiere mayores estudios clínicos y de campo para su validación definitiva.

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