Rev Med Exp.       Vol. 14 • Nº 2 • 1997

 

AISLAMIENTO Y MANTENIMIENTO IN VITRO DE
Plasmodium falciparum


Pardavé L. Blanca1,  Arce B. Cecilia1, Cabezas S. César2.

 

Resumen.-

Se aislaron 08 cepas de Plasmodium falciparum a partir de 10 pacientes. Luego fueron adaptadas y mantenidas en cultivo in vitro durante 60 días en eritrocitos humanos grupo O, en medio RPMI 1640 enriquecido con plasma humano grupo O, bajo una atmósfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de Nitrógeno y luego preservados a -70°C.

Palabras clave: Plasmodium falciparum, aislamiento, Perú.

Abstract.-

Eihgt strains of Plasmodium falciparum were isolated from 10 patients. They were adapted and maintained in culture during 60 days using human red celis, group O, RPMI 1640 medium and human plasma, group O, under 5% oxygen and 90% Nitrigen mixed gases. Finally, they were preserved at -70°C.

Key words: Plasmodium falciparum, isolation, Perú.

 

Introducción.-

La malaria o paludismo, es una enfermedad infecciosa producida por protozoarios del género Palsmodium y trasmitida por la picadura del mosquito del género Anopheles.

Esta enfermedad es endémica en nuestro país, donde circulan tres de las cuatro especies de Plasmodium: P. vivax, P. malarie, y P. falciparum causando esta última la malaria maligna que puede producir la muerte del hospedero [3].

En la actualidad se desconocen aún las cepas circulantes de P. falciparum en el país, su conocimiento es importante para comprender las características clínicas y epidemiológicas de la malaria maligna, según se ha demostrado en otras partes del mundo [1].

Para establecer las características mencionadas, una primera etapa es el aislamiento de P. falciparum en medio de cultivo a partir de casos conocidos de la enfermedad [2].

El desarrollo del parásito en los medios de cultivo nos permitirá mediante el estudio de la biología molecular del parásito, determinar las diferentes cepas de P. falciparum.

El trabajo se ha realizado con la finalidad de aislar P. falciparum en cultivo procedentes de diferentes regiones del país, iniciándose el estudio, en la zona de Loreto, por presentar las tasas más altas de infección por esta especie de Plasmodium [5].

Material y Métodos.-

OBTENCIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS:

Se colectó sangre venosa asépticamente en tubos heparinizados de 10 pacientes con diagnóstico parasitológico positivo (gota gruesa) para Plasmodium falciparum procedentes de las localidades de Santa Clara y Padre Cocha (Iquitos) y fueron transportadas desde la ciudad de Iquitos al Laboratorio del INS en Lima dentro de las 24 horas siguientes, conservadas en frasco termo a 4°C.

LAVADO DE LAS MUESTRAS:

Los glógulos rojos obtenidos fueron lavados tres veces en medios de cultivo RPMI 1640 incompleto (sin plasma). El sedimento fue resuspendido en 5mL de medio completo (RPMI 1640, suplementado con 25 mM de buffer HEPES, 25 mM bocarbonato de sodio, 25µL de sulfato de gentamicina y 10% de plasma humano grupo O, y el pH fue ajustado a 7,4). La concentración de glóbulos tenía hematocrito de 2% y se transfirió a frascos de 50mL para cultivo [6].

CULTIVO:

La metodología empleada para el cultivo fue descrita por Trager y Jensen [4].

Los parásitos fueron cultivados en medio RPMI 1640 completo para lo cual se utilizó una estufa a 37°C y una mezcla de gases de 5% CO2, 5% O2 y 90% de Nitrógeno. El medio fue cambiado cada dos días hasta que la concentración de parásitos se hizo detectable, a partir del cual se cambió diariamente el medio.

Eritrocitos frescos grupo O previamente lavados fueron añadidos al cultivo una vez por semana para aumentar el hematocrito al 2%. Cuando el porcentaje de parásitos alcanzó al 1%, estos fueron subcultivados para mantener las condiciones óptimas de los parásitos [6].

El conteo de células infectadas se hizo en base a 10,000 hematíes.

Los eritrocitos parasitados con formas anulares predominantes fueron criopreservados a 70°C en congeladora REVCO para un posterior estudio de la sensibilidad a las drogas antimaláricas, del patrón genético parásito, así como para la preparación de antígenos para pruebas serológicas (IFI y ELISA).

Resultados.-

De las 10 muestras prodecentes de igual número de pacientes en 02 se observaron gametocitos en la lámina del día 0 y en cultivos no se pudo recuperar la cepa.

De las 08 muestras restantes, la adaptación fue lenta en dos de ellas, una a los 23 días y otra a los 31 días. Las 06 restantes se adaptaron a los 7 días en promedio (Tabla 1).

 

TABLA N° 1
Cultivo de Cepas de P. falciparum.
Paciente Parasitemia inicial Fecha de obtención Fecha de siembra Observación de
desarrollo
Días
para adaptación
Procedencia de las cepas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3Fg
+F
++F
++F
++F
++F
2Fg
++F
++F
++F
15-04-97
15-04-97
15-04-97
15-04-97
15-04-97
15-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
16-04-97
17-04-97
17-04-97
17-04-97
17-04-97
ND
4 días
4 días
8 días
4 días
8 días
ND
11 días
11 días
8 días
-
7
77
6
23
7
-
31
4
6

Santa Clara (Iquitos)
Santa Clara (Iquitos)
Santa Clara (Iquitos)
Santa Clara (Iquitos)
Santa Clara (Iquitos)
Santa Clara (Iquitos)
Río Grande (Iquitos)
Padre Cocha (Iquitos)
Padre Cocha (Iquitos)
Padre Cocha (Iquitos)

 

Discusión.-

Es la primera vez que en el Instituto Nacional de Salud se logra aislar y mantener in vitro cepas de P. falciparum, siguiendo la técnica estandarizada por Trager y Jensen [4]. El contar con cepas aisladas y mantenidas in vitro permitirá realizar estudios de sensibilidad para drogas antimaláricas, considerando que la resistencia del P. falciparum viene construyendo un serio problema para su control.

Asimismo, a partir de los aislamientos se podrán realizar estudios de variabilidad genética, que permitirá evaluar la virulencia del parásito corno uno de los factores en la severidad o no de la infección por P. falciparum.


Bibliografía

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1. Laboratorio de Malaria, División de Parasitología.
2. Director General del Centro Nacional de Laboratorios de Salud.

 

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