DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA
LEISHMANIASIS
Montoya Ysabel1,2, Padilla
Carlos1, Nolasco Oscar1, León Carlos1,2,
Talledo Michael1, Choque Juana1, Cáceres Omar1, Barreto
Teresa1,
De Los Santos Maxy1, Campos lván1, Douglas Susan1,
Yabar Carlos1 y Barker Douglas3.
Resumen.-
El potencial diagnóstico de epitopes inmunodominantes seleccionados fue ensayado
satisfactoriamente a fin de obtener una prueba serodiagnóstica alternativa para la
Leishmaniasis Tegumentaria Americana. Dos proteínas recombinantes prometedoras de L. (v.)
peruviana referidas como T-26-U2/T26-U4 fueron reconocidas por sueros individuales de
pacientes con Leishmaniasis Tegumentaria Americana usando Western Blot. La sensibilidad de
la prueba fue de 86% con sueros permanentes con Leishmaniasis peruana.
Palabras clave: Western Blot, Suero Leishmania, Leishmaniasis.
Abstract.-
The potential diagnosis of selected immunodominant epitopes was successfully assessed as
an alternate serodiagnostic tool for American Tegumentary Leishmaniasis (ATL). Two
provisory recombinant proteins of L. (V) peruviana referred to as T26-U2/T26-U4 were
recognized by individual sera from ATL patients using Western blot. This test sensitivity
was 86% with peruvian leishmaniasis sera.
Key word: Western Blot, sera, Leishmania, Leishmaniasis. |
Introducción.-
Las leishmaniasis comprenden un grupo de enfermedades con doce a catorce millones de
personas infectadas en el mundo, con una incidencia de dos millones de casos nuevos
anuales, de ellos 1'500,000 son casos cutáneos y 368 millones de personas tienen riesgo
de infección en el mundo [1,2].
El Perú, como muchos otros países americanos, es afectado por la leishmaniasis
tegumentaria americana (LTA), causada principalmente por parásitos del complejo
braziliensis [4]. Dos formas clínicas han sido detectadas: la leishmaniasis cutánea
andina (LCA) conocida como uta, causada por L. (V.) peruviana y la leishmaniasis
selvática (LS) o espundia causada por L (V.) braziliensis. La uta causa lesiones
cutáneas benignas, responde al tratamiento clínico o autocura y se distribuye
principalmente en los valles interandinos. Por otro lado, la espundia es la forma más
severa de la enfermedad, causando lesiones mucocutáneas metastásicas desfigurantes y se
distribuye geográficamente en la selva [3]. Durante mucho tiempo, el diagnóstico de
leishmaniasis estuvo restringido al diagnóstico clínico y al examen parasitológico.
Posteriormente se incorporaron, los métodos inmunológicos tales como: ELISA y DOT-ELISA
usando proteínas totales como antígenos, los cuales están siendo usados para detectar
anticuerpos circulantes en pacientes con diferentes formas de la enfermedad [4]. Sin
embargo, el uso de antígenos totales presenta una especificidad limitada (65%) debido a
la presencia de epítopes compartidos entre patógenos come, T cruzi y Plasmodium.
La tecnología del ADN recombinante está permitiendo disponer de Kits de diagnóstico
altamente sensibles y específicos basados en proteínas recombinantes. Es decir, actual
mente es posible aislar un gen responsable de la expresión de una proteína e
introducirla a organismos como E. coli para que puedan ser mantenidos y perpetuados, de
tal manera que es posible utilizar estas bacterias como fábricas biológicas para la
producción y purificación de estas proteínas foráneas (proteínas recombinantes)
Usando esta estrategia Burns y col [2] y Schreffer y col [6], han obtenido proteínas
recombinantes para el diagnóstico de leishmaniasis visceral tales como K-392 y
la proteína recombinante rgp63. Por lo que resulta importante disponer de un Kit de
diagnóstico basado en el uso de proteínas recombinantes específicos y sensibles para el
diagnóstico de Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA).
Materiales y Métodos.-
PACIENTES Y SUEROS
Se obtuvieron sueros de pacientes con LTA de diferentes áreas geográficas del Perú y
remitidos al Instituto Nacional de Salud u obtenidos de los pacientes que llegaron al
Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt de la Universidad Peruana Cayetano
Heredia (Lima, Perú). Todos estos pacientes poseen historia clínica y fueron
diagnosticados clínica y serológicamente de uta (n=22), o LS (n=42) presentando lesiones
cutáneas (LCS=24) o mucocutáneas (LMS=18). Diez sueros de individuos sanos procedentes
de áreas no endémicas fueron usados como controles negativos.
Sueros de pacientes con otras enfermedades tales como: parasitarias, la enfermedad de
Chagas (n=15), malaria (n=5); las bacterianas, Bartonelosis (n=2), tuberculosis (n=4) y
micóticas, Paracoccidiosis (n=8), Esporotricosis (n=5) fueron incluidos en este estudio.
BIBLIOTECA DE ADNc DE (V.) peruviana E INMUNORASTREO DE CLONES RECOMBINANTES
Se preparó una biblioteca de ADNc en, el vector de expresión l gt11 a partir
de ARNm polyA+ extraídos de promastigotes de L. (V) peruviana en fase estacionaria. La
biblioteca de ADNc (25,000 ufp) fue inmunorrastreada con una mezcla de sueros provenientes
de pacientes LCA aislándose diez clones recombinantes que expresan proteínas de
fusión5,7. Para mayores estudios fueron seleccionados dos clones denominados T26-U2 y
T26-U4 por su alta reactividad frente a sueros de LTA.
EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Para la expresión y producción de proteínas recombinantes se utilizaron E. coli Y 1090
como hospederas del fago lgt11. Las bacterias incubadas en placas con medio LB-ampicilina fueron infectadas
e incubadas a 42°C por 4 horas y las proteínas recombinantes inducidas con IPTG por 3
horas a 37°C. Finalmente, las proteínas fueron colectadas y conservadas a-80°C.
ELISA Y WESTERN BLOT
Las técnicas de ELISA y Western Blot fueron utilizadas para detectar anticuerpos contra
el extracto crudo de par6sitos L.(V) braziliensis y los productos de expresión obtenidos
de los clones recombinantes respectivamente. Para el Western Blot, se sometieron 100 ug.
de protefnas totales de L. (V) braziliensis y 300 ug de protefna recombinante a
electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE al 10% y 7%), transferidas
a membranas de nitrocelulosa y enfrentadas a los sueros incluidos en el estudio.
Resultados.-
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE LESIHMANIA USANDO E. COLI COMO HUESPED
Fueron obtenidas satisfactoriamente las proteínas recombinantes de L (V) peruviana
referidas como T26-U2 y T26-U4 por la infección de sus respectivos bacteriófagos usando
E coli como huésped en el lapso de ocho horas. Se estima que la producción debe estar
por el rango de 500 ug a 1mg de proteína total por placa de cultivo, de los cuales el
[ilegible en el original]% constituye la proteína recombinante expresada. Esta cantidad
es suficiente para evaluar 150 a 200 sueros de pacientes por western blot.
El fago recombinante T26-U4 expresa con mayor eficiencia su proteína recombinante en
comparación con la obtenida por el fago T26-U2. Asimismo, el producto de expresión de la
clona T26-U4 fue más intensamente reconocido por los anticuerpos de los pacientes con
Leishmaniasisis Tegumentaria Americana. Sin embargo, los anticuerpos de los pacientes con
uta reaccionaron con mayor preferencia a la proteína recombinante T26-U2 que a la T26-U4.
Reactividad individual de las proteínas recombinantes con las formas clínicas de
Leishmaniasis
La proteína recombinante T26-U2 evaluada con sueros de pacientes con LTA presentó una
sensibilidad diagnóstica de 54% (Figura 1). Cabe mencionar que el 64% de los sueros de
pacientes con LCA, 46% con LCS y el 50% con LMS reaccionaron con la proteína T26-U2. En
contraste, la proteína recombinante T26-U4 presentó una reactividad para LTA, LCA, LCS y
LMS correspondiente a 78%, 59%, 62% y 89% respectivamente (Figura 1).
 |
Fig. 1: Reactividad
de las proteínas recombinantes frente a las formas clínicas de Leishmaniaisis en ensayos
de Western Blot. |
VALOR DIAGNÓSTICO DE T26 U2/T26 U4
Al combinar los resultados obtenidos con ambas proteínas recombinantes T26-U2/T26-U4, se
obtuvo un incremento significativo en la sensibilidad diagnóstica del test para LTA
(86%), valor comparable a la utilización de proteínas totales como antígeno, (92%)
(Figura 2).
La especificidad del test de diagnóstico usando ambas proteínas recombinantes es mayor
que cuando se utilizan proteínas totales, 87% versus 65% respectivamente (Figura 2). De
las dos proteínas recombinantes evaluadas, T26-U2 es la que muestra reacción cruzada con
el 40% de los sueros de pacientes chagásicos mientras que T26-U4 presenta una alta
especificidad al no reaccionar con los sueros de otras enfermedades. El valor predictivo
total del test diagnóstico T26-U2/T26-U4 usando suero a de pacientes con LTA fue superior
que el Western blot usando parásitos totales (87%versus 81%). (Figura 2).
 |
Fig. 1: Sensibilidad,
especificidad y valor predictivo total de ELISA con proteínas totales versus el test de
antígenos recombinantes en ensayos por Western Blot. |
Discusión.-
Una prueba para inmunodiagnóstico rápido y específico basado en el uso de proteínas
recombinantes ha sido desarrollado y evaluado para el diagnóstico de leishmaniasis en el
Perú con resultados satisfactorios.
Las proteínas recombinantes evaluadas mostraron una preferencia de reactividad de
epítopes en relación con cada forma clínica del paciente con leishmaniasis. La
proteína recombinante T26-U2 presento una reactividad preferencial con sueros de
pacientes cutáneos, (LCA=64%, LCS=58%) a diferencia de los obtenidos de los pacientes con
lesiones mucosas (37%). Sin embargo, la especificidad de la prueba se ve fuertemente
incrementado (87%) versus el obtenido con proteínas totales (65%). Esta especificidad
mejorada tendrá un impacto mayor en aquellas zonas geográficas donde coexisten
Leishmania y otros patógenos que comparten epítopes homólogos tales como la enfermedad
de Chagas.
Es importante mencionar que algunos sueros provenientes de pacientes infectados con
leishmaniasis de los departamentos de San Martín, Huanuco y Cuzco no presentaron niveles
de anticuerpos lo suficientemente altos para ser detectados por las proteínas totales,
sin embargo haciendo uso de las proteínas recombinantes pudieron ser detectados y recibir
un tratamiento apropiado.
La disponibilidad de estas proteínas recombinantes permitirá su uso como una herramienta
de diagnóstico sensible y específica. Esta tecnología nos ofrece la ventaja de no
cultivar in vitro al parásito y en contraste permite analizar rápidamente un gran
número de sueros (150 a 200 análisis) disminuyendo por ende los costos de preparación y
producción de antígenos para el diagnóstico de leishmaniasis.
Los insertos de las clonas T26-U2-U4 han sido secuenciados, su secuencia aminoacídica
deducida y con programas de computación se han seleccionado epítopes con valor
diagnóstico, los cuales permitirán simplificar y abaratar aun más los costos en el
diagnóstico de leishmaniasis.
AGRADECIMIENTO:
Esta investigación recibió financiamiento económico del Programa de la Unión Europea
(TS3*CT-0123) y del UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in
Tropical Diseases.
Bibliografía
__________________________________________
1. División de Biología Molecular, Centro Nacional de
Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud A.P 451 Lima, Perú.
2. Instituto Medicina Tropical "Alexander von Homboldt", Universidad Peruana
Cayetano Heredia, Perú.
3. Deparatamento de Patología, Universidad de Cambridge, Reino Unido.
|
