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La prolactina (PRL) es una hormona proteica sintetizada en las células eosinófilas de la hipófisis y regulada por la dopamina hipotalámica que inhibe su secreción
(1-3). La PRL es necesaria para el buen funcionamiento del tracto reproductivo masculino y femenino
(1-28). En el testículo, su acción la ejerce en las células de Leydig, aumentando la sensibilidad a la LH para la secreción de la testosterona (T)
(29-33), y. actuando a nivel de la captación de oxígeno por los espermatozoides (34); también se ha descrito una acción inhibitoria de la secreción pulsátil de hormona luteinizante (35, 36).
La hiperprolactinemia en el varón produce una serie de transtornos que indican deficiencia androgénica tales como hipogonadismo, impotencia, disminución de la libido, oligozooslermia e infertilidad (2, 4, 5, 13, 1624,
26-28). Otros reportes atribuyen también a la hipoprolactinemia alteraciones en la función reproductora masculina en animales (13, 7, 3740) y en humanos (41).
Por otro lado, se sabe que la exposición a la altura afecta la función hipófisotesticular tanto en humanos como en animales
(42-50). En cambio los nativos, como aquellos que permanecen largos periodos, muestran una adaptación a la altura (44, 45,
51-54) reflejada en una adecuada fertilidad. Diversos reportes muestran que en la exposición aguda o crónica a la altura hay alteraciones en la respuesta hormonal
(47,45-57); así, en hombres normales sometidos a hipoxia crónica, los niveles de PRI, y su respuesta máxima a la TRH endovenosa están disminuidos (58), en cambio en la exposición intermitente a la altura no se aprecian diferencias en los niveles basales de PRI, sérica (59).
Los estudios en animales han dado resultados contradictorios. Se reporta que la PRL tiene efectos estimulatorio (14,
60-62), inhibitorio (13, 24, 27, 28, 63, 64) y bifásico en la secreción de T (33).
En la hipoprolactinemia experimental por administración de Bromocriptina en roedores, ciertas publicaciones indican que se produce una inhibición de la secreción de T, asociado (25, 39) o no (65) a hipogonadismo y otras que incrementa la secreción de T (38). La administración de Sulpiride que incrementa los niveles de PRL, aumenta a su vez los niveles de T (66). En la hiperprolactinemia lograda con otros métodos experimentales se ha observado atrofia testicular (13,27,28).
Por lo tanto, nos propusimos además de revisar los efectos que la hipo- e hiperprolactinemia producida en ratas por la administración de la bromocriptina y la sulpiride (Dogmatil, Spedrog), conocidas inhibidora (67) y estimuladora (66) de la secreción de la PRL, tienen en la función testicular a nivel de mar (150 m), estudiar los efectos de estas drogas administradas a ratas llevadas a la altura (4540 m) en los niveles plasmáticos de PRL, T, y en la histología del testículo.
Se utilizaron ratas machos de la cepa Biología Andina. Todas nacieron y fueron criadas en Lima hasta la edad promedio de 70 días (peso entre 200 y 300 gr) en que un grupo (ALT) fue llevado a la ciudad de Morococha (4540 m) por 28 días. En esta edad la rata macho es considerada sexualmente madura y se obtiene el nivel más alto de testosterona plasmática (12).
Los animales fueron mantenidos en un cuarto previamente acondicionado con temperatura controlable, promedio 22°C recibiendo ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Se les administró agua
ad-libitum y fueron alimentados con productos balanceados: Engordina (Nicovita) evitando en lo posible el stress, el cual se sabe estimula la secreción de prolactina (68).
Para sangrarlos se colocó al animal en un cámara donde se les anestesia con vapores de éter por 2 minutos y se tomó la muestra por punción de la vena ocular del ángulo inferior del ojo. Se escogió el éter como anestésico el cual eleva los niveles basales de prolactina, al igual que otros anastésicos, pero lo hace en menor grado, dependiendo del tiempo de exposición. El tiempo escogido fue el que menos afecta y no tiene los efectos colaterales de la mayoría de los anestésicos (69).
Se realizó dos tipos de experimentos, cada uno con su propio grupo control:
Grupo Experimental I: Animales a los que se les administró Bromocriptina (2
Br-a-ergocriptina): CB-154-Sandoz, en dosis de 4 mgr/kg. de peso
corporal en 0.5 ml de solución salina 0.9% s.c., los días 0, 7, 21 y 28 de experimento con el, fin de obtener ratas hipoprolactinémicas.
El grupo control recibió 0.5 ml d solución salina 0.9% s.c. en igual tiempo.
Se escogió esta dosis de CB-154, por evidencias de que esta producía un descenso de la prolactina durante 7 días, a diferencia de otras dosis menores (67).
A nivel del mar se utilizaron 70 animales, 35 recibieron Bromocriptina y 35 solución salina al 0.9%. Cada grupo, de 35 animales, fue colocado al azar, en jaulas compuestas por 5 animales conformándose 7 grupos, numerados del 1 al 7.
En la altura se utilizaron 50 animales, 25 recibieron Bromocriptina y 25 solución salina al 0.9%. Cada grupo, de 25 animales, fue colocado al azar, en jaulas compuestas por 5 animales, teniendo 5 grupos numerados del 1 al 5.
A los 7, 14, 21 y 28 días, después de la primera inyección, los animales fueron pesados, se obtuvo la muestra de sangre y de cada grupo (jaula) se sacrificó al azar un animal, con el objeto de extraer los testículos, pesarlo y fijarlos en solución de Bouin, y ser enviados al Laboratorio de Histología para la preparación de las láminas para microscopía óptica.
De cada animal, se obtuvo aproximadamente 0.5 ml. de sangre. Cada muestra para análisis representa el "pool" de sangre de los 5 animales colocados al azar en una misma jaula y que representan un grupo. De esta manera se obtiene suficiente muestra para realizar los análisis. Las muestras fueron centrifugadas y el plasma mantenido en congelamiento
(-20°C), hasta realizar las determinaciones de prolactina y testosterona por radioinmunoanálisis (RIA).
Grupo Experimental II: Animales a los que se les administró Sulpiride
(N-(1 etil-2 pirrolidil-metil)-2 metoxi-5 sulfamoilbenzamida) Dogmatil-Spedrog, en dosis de 1.5 mg/kg de peso corporal en 0.5 mi de solución salina al 0.9% i.m. dos veces a la semana durante un mes con el fin de obtener ratas hiperprolactinémicas (66).
A nivel del mar se estudiaron 50 animales, 25 recibieron Sulpiride y 25 solución salina 0.9% i.m., distribuidos también en jaulas en grupos de 5. A los 7, 14, 21 y 28 días, después de la primera inyección, los animales fueron estudiados en forma similar a la descrita para el experimento con Bromocriptina.
Mediciones Hormonales:
Las hormonas fueron medidas por radioinmunoensayo (RIA).
Medición de prolactina
Los reactivos fueron proporcionados por A. F. Parlow, del National Institute of
Health (NIH/NIAMD) Rat Pituitary Hormone Programme a la Dra. Matilde de Bernal, del Laboratorio de Fisiología de la Reproducción de la Universidad del Valle,
Cali-Colombia y donada por ella para este trabajo.
La marcación de la prolactina de rata (NIAMD-Rat-Prolactin I-2) se realizó con I-125 por el método de la cloramina T. La hormona marcada fue purificada obteniéndose la
PRL,1-125 de mayor inmunoreactivídad y pureza, con una actividad específica entre 100 y 200 inCi/ nM.
Se analizaron las muestras de plasma utilizando anticuerpo antiprolactina de rata en conejo
(NIAMD-anú-rat-Prolactin-S-4). La separación de la fracción libre de la ligada, se hizo por precipitación con un segundo anticuerpo,
anti-gamaglobulina de conejo en carnero (Antibodies Incorporated). Los resultados obtenidos en las muestras fueron comparados por lectura directa sobre una curva standard obtenida con prolactina de referencia
(NIAMDRP-1). Los valores obtenidos se expresan como ng de NIAMD-RPI/nil de plasma. El coeficiente de variación intra e
inter-ensayo fue de 3.2% y 8.2% respectivamente, en un rango de 03200 ng/ml.
Medición de testosterona
Se utilizaron reactivos proporcionados por la Organización Mundial de la Salud, a la Dra. Matilde de Bernal, de la Universidad del Valle,
Cali-Colombia, como parte -del programa: "WHO Matched Reagent Programme" y donados por ella para este trabajo. El plasma (0.1ml) es extraído con éter, y los extractos se hacen reaccionar con el anticuerpo antitestosterona (OMS). La fracción ligada se contó en un contador de centelleo líquido. Los resultados se leyeron en una curva estándar previa corrección de la recuperación. El coeficiente de variación intra e
inter-ensayo fue de 4.5% y 7.3% respectivamente, en un rango de'0.1-40 ng/ml.
Procedimiento para la fijación de los testículos:
Inmediatamente después de extraídos y pesados los testículos fueron colocados enteros en solución de Bouin (ácido pícrico: 15 ml, formol 40%: 5 ml, ácido acético Q.P:1 ml). Una hora después se procedió a cortar los polos y a las 2 horas se realizó una sección transversal dejándolo en esta solución por 24 horas. Transcurrido este tiempo se procedió a un lavado continuo en chorro de agua por otras 24 horas; luego se colocaron en alcohol de 50% por 6 horas, pasándolo posteriormente a alcohol de 70% en donde permanecieron hasta ser enviados al Laboratorio de Histología para el montaje y coloración con
hematoxilina-eosina.
La alteración que representa el testículo se expresa como el número de túbulos por campo que presentaron algún tipo de alteración expresado en porcentaje (%AT). Se evaluaron 100 túbulos por lámina.
Análisis Estadístico
Los resultados fueron analizados usando análisis de varianza, análisis de regresión y la prueba "t" de Student para datos pareados. Los valores iguales o menores que 0.05.son considerados de significancia estadística.
Peso Corporal y de Testículos:
La exposición a la altura de ratas machos adultos disminuyó el peso corporal al día 7 de exposición y produce daño testicular, que se describe como desprendimiento y desorganización del epitelio germinal, presencia de células multinucleadas y engrosamiento de los vasos, así como una población normal de células de Leydig; la espermatogénesis está conservada en los túbulos no dañados. No se observaron cambios en el peso testicular con la exposición a la altura.
Los porcentajes de los valores hormonales obtenidos de los animales controles de ALT y tratados con bromocriptina o sulpiride a NM o ALT, están referidos al promedio de los valores durante todo el experimento (7, 14, 21 y 28 días) de los controles a NM, y que se consideran como el 100%.
En las ratas tratadas con bromocriptina a nivel del mar, la ganancia en peso corporal es de menor magnitud que en las no tratadas; a los 28 días los controles del nivel del mar ganaron 32% del peso corporal inicial y los tratados con bromocriptina sólo 17%. A los 21 días el peso de los testículos de los animales tratados con bromocriptina a nivel del mar es mayor con respecto a los 14 días (p<0.05).
Las ratas tratadas con bromocriptina en la altura, así como las no tratadas en la altura pierden peso corporal a los 7 días (p<0.001) pero a diferencia de ellas en las tratadas con bromocriptina se observa una recuperación del peso corporal a los 14 días (p<0.001), manteniéndose este peso hasta los 28 días en que los valores son similares a los de nivel del mar. No hay diferencia significativa en el peso de los testículos de las ratas tratadas con bromocriptina en la altura con el tiempo de exposición.
Los animales tratados con sulpiride a nivel del mar tienen a los 28 días una ganancia de peso corporal similar a los no tratados. No hay diferencia entre los pesos de los testículos con el tiempo de experimentación en los animales tratados con sulpiride a nivel del mar (P:NS). En la altura, los animales tratados con sulpiride al igual que los no tratados pierden peso observable a los 7 días (p<0.0l); este menor peso se mantiene sin variación de los 7 a los 28 días.
Niveles de Prolactina y Testosterona plasmática por la exposición a la altura
Las ratas llevadas a la altura tienen valores más altos de PRI, (p< 0.01), T (p<0.001) y % A.T. (p<0.0l) que sus similares a nivel del mar. Estos valores tienden a disminuir con el tiempo de exposición, siendo esta disminución significativa para T y para el %AT a los 21 días (p<0.05).
A los 7 días de exposición a la altura, La PRI, plasmática de las ratas representa el 153% del valor observado a nivel del mar y el valor de T en la altura representa el 240% del valor encontrado a nivel del mar
(Tabla
1).
Efectos de la bromocriptina a nivel del mar (NM) y en la altura (ALT)
A los 7 días, la bromocriptina administrada subcutáneamente en dosis de 0.4 mg/ kg p.c. a ratas expuestas agudamente a la ALT, no altera los niveles de PRL plasmática, lo que se logra con la dosis de 4 mgr/kg (p<0.0l)
(Tabla 2). La bromocriptina (4 mg/Kg) administrada a ratas a NM disminuye los niveles de PRL plasmática siendo significativo (p<0.001) de los 7 a 28 días de tratamiento, disminuyendo también los valores de T a partir de los 21 días (p<0.001). La Bromocriptina no produce incremento, adicional del %AT.
La bromocriptina administrada a las ratas en la altura tiene un patrón similar de respuesta de PRL que las de nivel del mar, reduciendo sus valores plasmáticos y disminuyendo desde los 7 días el incremento de T ocasionado por la altura. A excepción de lo encontrado a los 7 días, no se observa un incremento adicional en el %A.T. en los animales tratados con bromocriptina en la
altura(Tabla 3).
Efecto de la sulpiride a NM y en la ALTURA
La sulpiride administrada a ratas nivel del mar, incrementa gradualmente los niveles de PRL plasmática (p<0.001) de los a 28 días e incrementa los valores de T plasmática con respecto a las no tratadas, para luego disminuirlos gradualmente de los 7 a los 28 días, conforme se incrementan los valores de PRL plasmática. No hay incremento adicional del %AT en las, ratas tratadas con sulpiride a nivel del mar. En la altura, la sulpiride tiene un patrón de respuesta similar al del nivel del mar, incrementando los niveles de PRL y de plasmática. Al igual que lo observado en las ratas tratadas con sulpiride a nivel del mar los valores de T plasmática van disminuyendo gradualmente conforme se incrementan los valores de PRL. No se observa incremento adicional del %AT en las ratas tratadas con Sulpiride respecto a los controles en la altura
(Tabla 4).
Niveles de T plasmática según niveles de PRL plasmática
En la Tabla 5 observamos que hay un incremento de T plasmática paralelo al incremento de los niveles de PRI, plasmática tanto a nivel del mar como en la altura, hasta concentraciones de
PRI- entre los 41-60 ng/ml. Por encima de estos niveles de PRL plasmática, los valores de T plasmática tienden a disminuir.
Para determinar si los niveles de PRI, plasmática afectan los niveles de T plasmática se realizó la correlación entre las concentraciones de PRL y las de T utilizando los datos obtenidos a nivel del mar y en la altura en ratas control y tratadas, encontrándose una correlación poligonal (y = 5 sen2x, r = 0.876, p<0.05) en la cual el valor máximo de T se logra a la concentración de 50 ng/ml de PRL.
La PRL es necesaria para una normal función testicular y normal crecimiento de los órganos sexuales accesorios. A nivel testicular, la PRL incrementa y mantiene los receptores para LH, actuando sinérgicamente con la LH en la secreción de testosterona (T). A nivel de los órganos sexuales actuaría sinérgicamente con la T, en forma directa o incrementaría la conversión de T a dihidrotestosterona (DHT) en el tejido blanco
(29-33, 70, 71).
La exposición aguda a la altura de hombres (45,46,85) y animales (42-44,56, 72,
76-84) produce alteraciones en la función gonadal masculina, con daño testicular manifestado por alteraciones en la espermatogénesis tales como oligozoospermia, y azoospermia; disminución del peso testicular en ratas (49, 50, 80, 82), e incremento de la T plasmática en hombres (86) y animales (56).
En este trabajo estudiamos el efecto que la altura produce en los niveles de PRL plasmática, relacionándolos con los niveles de T plasmática y comparándolos con, los del nivel del mar. Con el objeto de obtener niveles
bajos y altos de PRL, utilizamos la administración de Bromocriptina y Sulpiride respectivamente. La Bromocriptina, estimula los receptores de dopamina a nivel hipotalámico e hipofisario y por lo tanto inhibe la secreción de prolactina, demostrándose en ratas machos también una disminución de los niveles de
testosterona (67,89). El Sulpiride bloquea los receptores dopaminérgicos (66), y además de aumentar los niveles séricos de prolactina también aumenta los de testosterona (15).
Nuestros resultados muestran que las ratas llevadas a la altura incrementan los valores de prolactina plasmática (p<0.0l). Es indudable que al llevarlos a un ambiente diferente, el traslado en sí producirá stress, el cual se sabe incrementa la secreción de PRL, pero considerando que la exposición aguda a la altura incrementa los niveles de serotonina sanguínea, estimulador de la secreción de PRL, y disminuyen los de dopamina, inhibidor de su secreción (56,94), podrían ser estas sustancias las causas del incremento de la PRL durante la exposición aguda a la altura (56).
Posterior a la elevación de la PRI, plasmática en las ratas llevadas a la altura, hay una disminución gradual con el tiempo de exposición, haciéndose significativa (p<0.0l) a partir de los 21 días.
La exposición aguda a la altura incrementó los niveles de testosterona sérica. Estos resultados están de acuerdo con otras publicaciones en ratas y humanos (56, 85, 86). Hay publicaciones que reportan que los niveles de T disminuyen de la 4ta. a la 20ava. semana de exposición a la altura (80, 85).
La mayoría de reportes asocian la hiperprolactinemia con disminución de los niveles de T (1, 2, 13,
18-20, 32); sin embargo es necesario recordar que la acción fisiológica de la PRL en las células de Leydig es incrementar su sensibilidad a la LH, incrementando la secreción de T
(29-33). Si bien la exposición aguda a la altura determina un aparente estado hiperprolactinémico, comparando el valor medio de PRL en las ratas a nivel del mar: 23.67 +_ 0. 15 con los valores de las ratas en la altura, por Ej. a los 7 días: 36.39 ± 0.72, observamos que como valores absolutos no son muy distantes, encontrándonos en los niveles de PRL que producen incremento de T (Rango normal). Fung (33) en estudios "in vitro" demuestra que los efectos de la PRI, en la secreción de T son dosis dependientes.
La alteración testicular observada en las ratas control expuestas a la altura, evidenciada por desprendimiento y desorganización del epitelio germinal, presencia de células multinucleadas y engrosamiento de los vasos, es similar al reportado por otros autores (7983) y ha sido atribuido a la acción directa de la serotonina sanguínea que se incrementa por la exposición a la altura (84,88); esto se comprueba con el hecho de que la modificación de los niveles de prolactina y testosterona producidos por la bromocriptina y el sulpiride no modifican la alteración testicular producido por la altura.
Como lo ya reportado (49,50,80,82), las ratas expuestas a la altura pierden peso corporal, pero no testicular. Algunos autores encuentran disminución del peso testicular en las primeras semanas de exposición aguda a la altura (49,82); otros lo reportan a las
7-10 semanas de exposición (80).
Las ratas tratadas con bromocriptina tanto a nivel del mar como en la altura, al disminuir los niveles de PRL plasmática, disminuyen los niveles de T como lo descrito en la mayoría de reportes (25, 39, 65, 89), no observándose mayor alteración testicular. La disminución de T y el incremento del %AT observado a los 7 días en las ratas tratadas con Bromocriptina en la altura, no parece deberse a un efecto de la disminución de PRL, debido a que a los 14, 21 y 28 días, en que los niveles de PRL son menores no se observan similares resultados.
De los resultados observados en la variación del peso corporal en las ratas tratadas con Bromocriptina: poca ganancia a nivel del mar, y recuperación del peso perdido por efecto de la altura, a partir de los 14 días, no nos permiten deducir alguna relación entre la PRL y el peso corporal. La disminución de peso corporal en la exposición aguda a la altura en ratas ha sido relacionada con el incremento de la serotonina sanguínea (50).
Al igual que lo observado por otros autores (65,66) el Sulpiride incrementa los niveles de PRL plasmática tanto a nivel del mar como en la altura, con un incremento de T plasmática, pero a diferencia de ellos encontramos una disminución de estos niveles a valores muy altos de PRL.
Si observamos la curva de correlación entre PRL y T notaremos que a niveles de PRL altos, se puede tener T plasmática mayores o iguales a los valores normales encontrándonos en el lado de la curva en que se observa una relación inversa entre PRL y T. Con concentraciones de PRL plasmática mayores de 90 ng/ml e inferiores a 8 ng/ml se obtienen valores de T plasmática inferiores a los controles de nivel del mar, los que pueden ser considerados como valores normales.
En conclusión, nuestros datos revelan que en ratas machos adultos, la exposición aguda a la altura produce un incremento de la prolactina, y testosterona plasmática y daño en la espermatogénesis; y que el incremento en la testosterona sérica parece deberse al incremento de la prolactina.
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Centro de Investigaciones Biología Andina
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
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